微量板倍量稀釋法檢測IgG抗A(B)效價改進研究

陳海江 丁杰鋒

產前檢測IgG抗A(B)血型效價是預測和判斷ABO血型不合新生兒溶血病(haemolytic disease of the newborn，HDN)的主要依據，并且HDN癥狀隨著母體IgG抗A(B)血型效價水平的提高而遞增［1］。目前實際應用中醫院主要采用微柱凝膠抗人球蛋白試驗法(microcolumn gelCoombstest，MG － Coombs'T)檢測IgG抗A(B)效價。此法沒有全國統一操作標準，各個醫院有不同的實驗方法。不同的實驗方法會導致不同的結果，無法進行相互比較，而且如果實驗操作步驟設計不合理、不科學會導致結果失真和較低重復性，因此對實驗操作方法進行優化是保證結果準確性和重復性的重要前提。本文采用微量板倍量稀釋法進行稀釋，從比較裂解液(2－Me、DTT)類型與稀釋比例、裂解液處理時間和細胞溫浴時間差異對結果的影響，綜合得出最佳操作方案，將此方案與試管倍量稀釋法進行比較，判斷改進后的效果［2］。

材料與方法

1．標本來源:2011年7～8月來筆者醫院進行產前檢查的O型孕婦110例，其中進行IgG抗A測定47例，進行IgG抗B測定49例，進行IgG抗AB測定14例。孕婦年齡在22～29周歲之間，孕周在12～38周之間。

2．試劑和儀器:0．2mol/L 2巰基乙醇(2－Me)、MG －Coombs'試劑卡、37℃恒溫孵育箱、卡式離心機由長春博迅(Bioxun)生物技術有限公司提供;0．2mol/L二硫蘇糖醇(DTT)自配，二硫蘇糖醇由加拿大SIGMA－Aidrich公司生產。96孔酶標板。0．8%的紅細胞懸液自配。

3．方法:(1)對實驗條件進行優化，選取兩個標本:一個效價高值，一個低值，兩例均為IgG抗AB檢測。每次操作均將此2例標本重復測定3次，取平均值。①比較裂解液(2－Me、DTT)類型與稀釋比例對結果影響。按下表1設置以下4組。將此2例孕婦標本加到酶標板每行第1孔，均按每組設置的裂解液類型和稀釋比例進行處理，在37℃恒溫孵育箱溫浴1h。取出后在酶標板每行后面幾孔進行倍比稀釋。每孔起加0．8×10－2mol/L的AB型紅細胞懸液。置37℃恒溫孵育箱孵育30min，后吸取至微柱卡置卡式離心機離心。以2+凝集為判定終點;②比較裂解液處理時間差異對結果的影響。裂解液類型及量稀釋方案取表1第3組，即300μl DTT加100μl血清，在37℃恒溫孵育箱溫浴處理時間分為 15min、30min、60min、120min 4組，其他操作步驟同前;③比較細胞溫浴時間差異。裂解液類型及量稀釋方案取表1第3組，即300μl DTT加100μl血清，將細胞溫浴時間分為 15min，30min，60min 3組，其他操作步驟同前。(2)對以上3步進行綜合分析并改進，得出最佳操作方案，將此方案用微量板倍量稀釋法對110例孕婦血清標本測定，同時再用試管倍量稀釋法重新測定，得出兩組結果，比較差異［2］。

表1 裂解液類型及量稀釋血清情況

結 果

1．不同的實驗條件對結果的影響及最佳實驗方案:(1)裂解液(2－Me、DTT)類型與稀釋比例對結果影響情況:從圖1可看出，DTT與血清比例為1∶1時，對結果有些影響，而當DTT與血清比例為3∶1、7∶1時結果與2－Me與血清比例1∶1相同。實驗結果顯示DTT與血清比例最好為3∶1。(2)裂解液不同處理時間對結果的影響情況:從圖2可以看出處理時間太短，對低值標本結果影響較大，易使其結果偏高;處理時間太長會導致高值標本結果降低。筆者取裂解液最佳處理時間為60min。(3)細胞溫浴時間差異對結果影響情況:從圖3可以看出，溫浴時間較短對高值結果有一定影響，筆者取最佳溫浴時間為30min。(4)實驗操作改進后的最佳方案:取DTT與血清比例為3∶1，37℃ 處理時間為 60min，細胞溫浴時間為30min。

圖1 不同裂解液(2－Me、DTT)、不同稀釋比例與結果關系

2．改進后的方法與試管倍量稀釋法進行測定:110例孕婦標本，得出結果比較見表2。由表2可以得出，改進后的操作方法與試管倍量稀釋法比較結果差異在統計學上無顯著意義(P＞0．05)。

表2 改進方法與試管倍量稀釋法效價結果比較(x±s)

討 論

產前孕婦IgG檢測在國內開展已有10余年的歷史。最為經典的是試管倍量稀釋法，由于其操作繁瑣，耗時長，人力勞動投入多，重復性較低，只適合少量標本檢測。在具有大批量標本檢測的實驗室里基本摒棄不用，而主要采用微量板倍量稀釋法。免疫微量板易得，價格低廉，可以代替試管進行稀釋，運用8通道排槍可以進行倍比稀釋，能節約很多時間，并且提高了準確性和重復性，這是其得到了大量應用的主要原因。但是目前對于微量板倍量稀釋法操作沒有統一的標準。

由于目前檢測效價都是采用手工方法，在檢測過程中容易受到各種實驗條件和人的主觀干擾。裂解液經典方法推薦使用2巰基乙醇(2－Me)，但是由于其具有惡臭味，氣味較濃，對人體損害較大，很多實驗者采用二硫蘇糖醇(DTT)。其氣味很淡，反應快速，易于被接受，但對IgM的裂解能力較差［3］。從圖1、圖2中可以看出，DTT裂解液比例較低、處理時間較短容易致IgM破壞不完全，尤其是低值標本，結果易表現為IgM型，而且開始稀釋比例較低，會增加稀釋個數，使手工操作的誤差加大，影響實驗結果，如圖1第2組高值標本;相反，如果DTT裂解液比例過大、處理時間過長的話容易導致蛋白變性，對IgG破壞較大，使檢測結果偏低，尤其是高值標本，更易致結果不準，而且一開始比例過大使試劑消耗太多。所以筆者認為DTT與血清比例為3∶1、37℃處理60min是科學、有效、適宜的。對于細胞溫浴時間筆者認為30min足夠了，時間太短容易使IgG與紅細胞結合不完全，容易使結果偏低;時間太長容易導致細胞變性影響結果觀察，而且會使實驗操作過程延長，降低了效率。因此，我們得出了改進后的最佳操作方案:DTT與血清比例為3∶1、37℃處理60min、細胞溫浴時間為30min。此方案用微量板倍量稀釋法與試管倍量稀釋法比較結果差別很小，可替代試管倍量稀釋法。

本研究從操作過程中的幾個重要步驟進行優化，得出了最佳的操作方案。在最后一步檢測時，大多數實驗室采用微柱凝膠卡法。有研究證實比傳統試管法操作更簡便、快捷，應用于孕婦產前效價檢測有更高的靈敏度，而且在應用過程中感受到此卡結果易于判斷和保存，能極大地減少了主觀誤差。因此改進后的方法是準確、有效的，更適合實驗室進行大批量標本檢測［4］。

1 Hadley AG．Laboratory assays for predicting the severity of haemolytic disease of the fetus and newborn ［J］．Transpl Immunol，2002，10(2):191－198

2 夏琳．臨床輸血診療技術［M］．北京:人民衛生出版社，2008:101－102

3 孫桂香，張曉娟．唾液、DTT、2－Me三種物質對IgM抗體中和能力的比較［J］．科學與技術工程，2007，7(8):1723 －1724

4 李凌波，王冬倩，陳云聲，等．國產微柱凝膠免疫檢測試劑卡檢測孕婦IgG血型抗體效價的實驗研究［J］．中國免疫學雜志，2008，24:1138－1140