高效液相色譜法同時測定雙黃消炎片中黃芩苷和黃芩素含量

徐占方，陳立柱，姜雪敏，孫 菲

(黑龍江省雞西市藥品檢驗所，黑龍江 雞西 158100)

雙黃消炎片由三顆針、黃芩兩味中藥組方，具有消炎之功效[1]，可用于咽喉痛、腹瀉、痢疾、慢性痢疾等癥，現行質量標準只有顯微鑒別和黃酮類化合物的定性鑒別，無對黃芩主要成分的定量檢測，無法有效控制產品的質量。黃芩質量好壞直接影響藥品的療效，黃芩的主要成分有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素[2]。對雙黃消炎片中黃芩苷的高效液相色譜(HPLC)法測定已有報道[3-5]，但僅用黃芩苷一種成分的含量不能全面地反映黃芩的質量。筆者建立了可同時測定雙黃消炎片中黃芩苷、黃芩素兩種主要成分含量的高效液相色譜法，報道如下。

1 儀器和試藥

HP1100型高效液相色譜儀，HP1100型工作站(自動進樣，紫外檢測器);Sartorius電子天平;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。黃芩苷對照品(批號為110715-200815，含量為95.2%)，黃芩素對照品(批號為111595-200604)，均購自中國藥品生物制品檢定所;雙黃消炎片(市售樣品3批，批號分別為20100924和20100305，通化萬通藥業有限公司;批號為20080701，吉林省俊宏藥業有限公司);其他試劑均為色譜純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以甲醇(A)-0.4%磷酸溶液(B)為流動相梯度洗脫，40%A(0 min)，80%A(40 min)，40%A(60 min);檢測波長:277 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:10μL;柱溫:30℃。在此條件下，理論板數不低于5 000，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取樣品適量(約相當于平均片重)，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇40 mL，超聲提取40 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密吸取5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。分別精密稱取經P2O5干燥過夜的黃芩苷對照品29.82 mg和黃芩素對照品10.61 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，濾過，作為對照品貯備液。按雙黃消炎片的處方、制法項下不加黃芩粉末，制備陰性樣品，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:分別精密量取黃芩苷、黃芩素對照品貯備液1.0和0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，按上述色譜條件，分別進樣 1，2.5，5，10，15，20，25μL，以峰面積 Y對質量濃度 X(μg/mL)進行回歸分析。黃芩苷回歸方程為 Y=37.45X+11.84，r=1.000 0(n=7)，黃芩苷質量濃度在5.678～142.0μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好;黃芩素回歸方程為 Y=61.55X-1.691，r=1.000 0(n=7)，黃芩素質量濃度在2.122～53.05μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取對照品溶液(含黃芩苷56.78μg/mL，黃芩素21.22μg/ml)，重復進樣5次。結果黃芩苷和黃芩素峰面積值的RSD分別為0.1%和0.3%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12，16，24 h時重復進樣。結果黃芩苷和黃芩素峰面積的 RSD分別為0.6%和0.7%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗:分別精密稱取同一樣品(批號為20080701)5份，依法制備供試品溶液并測定。結果黃芩苷和黃芩素平均含量分別為29.53 mg/g和9.053 mg/g，RSD分別1.2%和1.1%(n=5)，表明方法重復性較好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為20080701，平均片重為0.401 2 g)約0.2 g共6份，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入對照品溶液(含黃芩苷2 917μg/mL和黃芩素 909 μg/mL)2.4，2.4，2.0，2.0，1.6，1.6 mL，加 70%乙醇溶液適量，超聲40 min，放至室溫，用70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜濾過，進樣10μL，測定含量，計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于平均片重)，按2.2項下方法制備供試品溶液。按擬訂的色譜條件進樣10μL，按峰面積外標法測定含量。結果見表2。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

表2 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

分別取黃芩苷和黃芩素對照品適量，用流動相稀釋到一定的質量濃度，照紫外分光光度法，在200～700 nm波長范圍內掃描。結果黃芩苷、黃芩素的最大吸收波長分別是279 nm和277 nm，但在277 nm處黃芩苷和黃芩素分離效果好，故將測定波長確定為277 nm。

為在相對較短的時間內獲得滿意的分離效果，故采用梯度洗脫，色譜柱選用250 mm的長柱。流動相開始采用磷酸鹽緩沖液-乙腈，黃芩苷和黃芩素分離效果不理想，采用甲醇和磷酸溶液定，梯度洗脫后取得了較好的分離效果。

在試驗過程中，考察了單純用甲醇超聲30 min提取、70%乙醇超聲30 min提取、70%乙醇加熱回流3 h提取的效果，結果表明，用甲醇超聲提取黃芩苷提取不完全，加熱回流方法雖提取得徹底但比較費時費力，最終選用70%乙醇超聲40 min提取。幾種方法提取黃芩苷的差異較大。

本品的現行質量標準控制水平較低，僅對雙黃消炎片中黃芩有顯微鑒別，沒有黃芩主要成分的定量檢測。這給不法分子以可乘之機，以次充好，降低生產成本，但卻影響了藥品的療效。而且在實際的監督中，藥品檢驗部門按現行標準檢驗，只能出具合格報告書，不能定其為不合格產品。本含量測定方法的建立，對現行標準是有效的補充和提高。

[1]WS3-B-0235-90.中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第二冊)[S].

[2]南京中醫藥大學.中藥大辭典(下冊)[M].第2版.上海:上海科學技術出版社，2006:2 806.

[3]莫海濤，劉 元，宋志釗.HPLC測定雙黃消炎片中黃芩苷含量[J].中國民族民間醫藥，2009，18(17):24-25.

[4]宋吉蓮，呂鳳蓮，袁明輝.HPLC測定雙黃消炎片中黃芩苷含量[J].中國藥事，2005，19(11):47-48.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:212.