阿托伐他汀通過抑制PKC的激活對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激反應*

柴大軍, 寧若冰, 祝 江, 許昌聲, 謝 泓, 林金秀

(福建醫科大學附屬第一醫院心內科，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

1000-4718(2012)09-1537-06

2012-04-17

2012-07-18

國家自然科學基金青年基金資助項目 (No.30900586)

△通訊作者 Tel： 0591-87982516； E-mail: caidajun@medmail.com.cn

·論著·

阿托伐他汀通過抑制PKC的激活對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激反應*

柴大軍△, 寧若冰, 祝 江, 許昌聲, 謝 泓, 林金秀

(福建醫科大學附屬第一醫院心內科，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

目的探討阿托伐他汀對高糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)產生氧化應激的影響及其作用機制。方法體外培養HUVECs，以25 mmol/L葡萄糖干預，模擬糖尿病患者體內環境，通過流式細胞術和共聚焦顯微鏡檢測細胞內的活性氧(ROS)水平，采用Lucigenin分析方法測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，分別應用實時熒光定量PCR和免疫印跡雜交的方法檢測 NADPH氧化酶亞基Nox4和Nox2/gp91phox的表達水平，用免疫印跡雜交方法檢測蛋白激酶C (PKC)蛋白的磷酸化水平。結果(1)在高糖環境(終濃度為25 mmol/L)下，HUVECs內ROS生成顯著增加，NADPH氧化酶的活性顯著增強，NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基的mRNA和蛋白表達水平顯著上調；(2)阿托伐他汀可顯著抑制高糖誘導的ROS 生成、NADPH氧化酶活性的增強及NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基表達水平的增加幅度，且具有濃度依賴性；(3) PKC抑制劑(PKC inhibitor peptide, 20 μmol/L)可顯著抑制高糖環境下ROS的生成、NADPH氧化酶活性的增強及NADPH 氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基表達水平的增加幅度；(4) 阿托伐他汀可抑制高糖誘導的PKC蛋白的磷酸化。結論PKC的活化參與了高糖誘導的HUVECs產生的氧化應激反應。阿托伐他汀通過抑制PKC蛋白的活化對抗高糖誘導的內皮細胞產生的氧化應激反應。

高糖; 氧化應激; 他汀類; 蛋白激酶C

糖尿病已成為全球性的健康問題，而糖尿病患者體內血糖升高能通過多種信號途徑激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶的活化增加，進而引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成增加，對血管內皮細胞產生氧化應激損傷，加速了動脈粥樣硬化的形成[1]。NADPH氧化酶是血管內皮細胞ROS的主要來源，由NADPH氧化酶4 (NADPH oxidase 4, Nox4)、NADPH氧化酶2( NADPH oxidase 2, Nox2/gp91phox)和p22phox蛋白等多個亞基組成[2]。有許多研究表明ROS產生過多與心血管疾病的發生和發展密切相關。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)不僅是二酰甘油(diacylglycerol, DAG) 和佛波酯腫瘤啟動子的下游靶點，也參與了對血管內皮細胞NADPH氧化酶的調控[3]。高血糖能引起血管組織中DAG-PKC通路的激活，抑制PKC的活化可以顯著改善糖尿病和高糖對血管內皮功能的損傷[3-4]。 他汀類藥物作為目前降脂治療的關鍵用藥，其在降脂作用之外所具有的抗動脈粥樣硬化等作用可能與其抗氧化能力有關[5-6]。本研究將討論阿托伐他汀在高糖誘導的人血管內皮細胞產生的氧化應激反應過程中的作用及相關機制，為阿托伐他汀心血管保護作用的發揮尋求新的分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

M199培養基，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液、Trizol和Opti-MEM購自Invitrogen；real-time PCR試劑盒購自TaKaRa； 2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯(2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2-DCFDA)、二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)和I型膠原酶購自Sigma；PKC抑制劑(PKC inhibitor peptide)購自Millipore；鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人PKC單克隆抗體、羊抗人p-PKC多克隆抗體和羊抗人Nox4多克隆抗體購自 Santa Cruz；兔抗人Nox2/gp91phox多克隆抗體購自Abcam。

2方法

2.1人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的培養 參照文獻[7]的方法,從健康臍帶的臍靜脈應用0.1% I型膠原酶消化和分離內皮細胞，細胞離心收集后接種于預先用0.1%明膠包被的培養瓶內并用M199培養基+20% FBS+25mg/L內皮細胞生長因子+90 mg/L肝素在37 ℃、5%CO2的培養箱內進行培養。依據細胞典型的鋪路石樣生長形態，免疫熒光法檢測細胞Ⅷ因子抗原等方法鑒定HUVECs，細胞的純度在95%以上。為避免多次傳代過程中細胞發生與存活時間相關的變化，本研究中僅選用1～3代細胞用于研究。

2.2HUVECs的干預和分組 25 mmol/L高濃度葡萄糖常被用來刺激內皮細胞，體外模擬糖尿病患者的體內高糖環境[8]。等摩爾甘露醇作為對照以排除高糖干預時因細胞外滲透壓急性改變產生的細胞學效應。將細胞分為正常組(葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)、25 mmol/L甘露醇組和高糖組(葡萄糖終濃度為25 mmol/L)、高糖+阿托伐他汀(0.01 μmol/L)組、高糖+阿托伐他汀(0.1 μmol/L)組、高糖+阿托伐他汀(1 μmol/L)組和高糖+PKC抑制劑組。

2.3流式細胞術檢測細胞內活性氧離子的水平 H2-DCFDA是一種脂溶性熒光底物，能順利通過細胞膜。進入細胞后，被細胞內的ROS氧化后變成2’，7’-dichlorodihydrofluorescein，后者產生可被流式細胞儀檢測到綠色熒光。細胞干預結束后，于培養液內加入10 μmol/L H2-DCFDA, 37 ℃、5%CO2培養箱內培養60 min，吸去培養液，用預溫的PBS洗細胞1次，用0.25%胰酶-EDTA消化細胞制成細胞懸液。采用525 nm波長濾光片進行流式細胞儀檢測各標本的陽性細胞比例和熒光強度。

2.5NADPH氧化酶活性測定 NADPH氧化酶活性測定采用Lucigenin分析方法，具體方法參照我們已發表文獻[9]。

2.6逆轉錄和real-time PCR HUVECs被干預結束后，采用real-time PCR試劑盒依據產品說明進行細胞RNA的提取、逆轉錄和real-time PCR。Nox4引物序列：正義鏈 5′- AGG GCC AGA GTA TCA CTA CCT CCA C-3′，反義鏈5′- TGA TCC TCG GAG GTA AGC CAA G -3′； Nox2/gp91phox引物序列： 正義鏈5’-AAA TGG ATC GCA TCT GTG AC-3’，反義鏈5’-TGG CCA CAC TAA CAG TGA TTT AGA G-3’； 內參照GADPH引物序列： 正義鏈5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，反義鏈5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。所有引物序列由TaKaRa公司合成。

2.7細胞蛋白的提取和免疫印跡雜交 提取細胞總蛋白，煮沸變性10 min，采用12% SDS-PAGE電泳分離50 μg細胞蛋白樣品，轉至PVDF膜后用特異的抗Nox4、Nox2/gp91phox及p-PKC抗體進行免疫雜交檢測，β-actin作為內參照。

3統計學處理

結 果

1阿托伐他汀呈濃度依賴性下調高糖誘導內皮細胞產生的ROS水平

流式細胞術的結果顯示，高糖(25 mmol/L)干預8 h后內皮細胞內ROS水平顯著增加(8.04±0.45vs1.30±0.38，P<0.05)，甘露醇干預8 h未顯著增加細胞內的ROS生成，阿托伐他汀呈濃度依賴性(10-8mol/L～10-6mol/L)地抑制高糖環境下 HUVECs內ROS的生成，見圖1。熒光顯微鏡觀察結果也顯示，高糖干預使得內皮細胞內DHE產生的紅色熒光強度顯著增強，阿托伐他汀(10-6mol/L)顯著降低高糖誘導下內皮細胞ROS的生成，見圖2。

圖1阿托伐他汀抑制高糖環境下人臍靜脈血管內皮細胞內ROS的水平

Figure 2. Effects of atorvastatin and PKC inhibitor on high glucose-induced ROS production in HUVECs.

圖2阿托伐他汀和PKC抑制劑抑制高糖環境下HUVECs內ROS的水平

2阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制NADPH氧化酶活性

不同濃度(10-8mol/L～10-6mol/L)的阿托伐他汀預處理HUVECs 1 h后，再給予高糖干預8 h，結果發現阿托伐他汀呈濃度依賴性地抑制NADPH氧化酶的活性，見圖3。

3阿托伐他汀抑制高糖誘導的內皮細胞NADPH氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基的表達

阿托伐他汀呈濃度依賴性下調高糖誘導下Nox4(圖4A)和Nox2/gp91phox(圖4B)mRNA增加的幅度。10-7mol/L濃度阿托伐他汀干預時呈現出抑制效應, 10-6mol/L濃度阿托伐他汀的抑制作用較10-7mol/L濃度顯著增強。我們采用免疫印記雜交方法進一步證實了阿托伐他汀對高糖環境下Nox4(圖4C)和Nox2/gp91phox(圖4D)亞基蛋白表達的抑制效應。

4PKC參與高糖誘導HUVECs產生的氧化應激反應

分別用2 μmol/L和20 μmol/L PKC抑制劑預處理HUVECs 45 min后，再進行高糖干預。PKC抑制劑呈濃度依賴性(2～20 μmol/L)地抑制高糖環境下ROS的生成(圖5A)及NADPH氧化酶的活化(圖5B)，共聚焦顯微鏡檢測結果顯示20 μmol/L PKC可顯著降低高糖環境下細胞內的ROS熒光強度(圖2)；同樣，20 μmol/L PKC抑制劑顯著抑制高糖誘導NADPH氧化酶Nox4(圖5C)和Nox2/gp91phox(圖5D)的表達

圖3阿托伐他汀抑制高糖環境下人臍靜脈血管內皮細胞內NADPH氧化酶活性

。

5阿托伐他汀抑制高糖誘導下PKC的活化

如圖6所示，10-8mol/L～10-6mol/L阿托伐他汀預處理HUVECs 1 h后，再暴露于高糖環境15 min，發現阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制高糖誘導的PKC的磷酸化水平。

討 論

糖尿病患者體內具有較高的氧化應激水平，氧化應激參與血管內皮細胞病理生理變化過程的各個環節，血管內皮細胞氧化應激損傷也是動脈粥樣硬化病變的基礎[1]。血管內皮中氧化應激損傷主要源于線粒體電子傳遞鏈、一氧化氮合酶、NADPH氧化酶等多種途徑產生的ROS，而NADPH氧化酶是內皮細胞內ROS最主要的來源[2]。NADPH氧化酶作用的發揮有賴于其在胞漿中的亞基p47phox、p40phox、p67phox與胞膜上的亞基p22phox、Nox2/gp91phox結合并形成完整的有生物活性的NADPH氧化酶復合體。催化亞基Nox2/gp91phox和調節亞基p22phox在細胞膜上形成異二聚體(即黃素細胞色素b558)，位于胞漿的亞基可對其進行調節[10-11]。我們前期研究已證實Nox4、p22phox和Nox2/gp91phox亞基參與高糖環境下HUVECs內NADPH氧化酶的活化[9]。本研究中我們再次證實了高糖通過促進NADPH氧化酶的活化上調血管內皮細胞內ROS的生成，與前期結果一致。

他汀類藥物是目前臨床上用來控制血脂水平的一線用藥，是膽固醇生物合成過程中限速酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，能夠降低總膽固醇和低密度脂蛋白并升高高密度脂蛋白。

圖4阿托伐他汀抑制高糖誘導下血管內皮細胞內NADPH氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基的表達

圖5PKC抑制劑對高糖環境下細胞內ROS生成、NADPH氧化酶活性及NAPDH氧化酶Nox4和Nox2/gp91phox亞基表達的影響

圖6阿托伐他汀抑制高糖誘導的PKC磷酸化

許多研究表明他汀具有“非降脂相關的心血管保護作用”，主要包括抗氧化應激作用、改善血管內皮功能、抗炎等作用[12-14]，但其相關的分子機制依然值得探討。本研究中，我們發現阿托伐他汀能顯著下調高糖環境下Nox4和Nox2/gp91phox亞基的表達，且具有濃度依賴性，提示阿托伐他汀可對NADPH氧化酶的主要亞基進行轉錄或轉錄后的調控。阿托伐他汀對NADPH氧化酶亞基表達水平的調控效應可能是其在高糖環境下抑制NADPH氧化酶活性和下調ROS生成水平的重要機制之一。

PKC具有多種亞型，在靜息狀態下主要以無活性的狀態存在于胞漿中，是細胞內信息傳遞中的重要分子。PKC受到外界刺激時通過上游信號分子的磷酸化作用使其構象改變而激活，是多條信號通路的交匯點。高濃度葡萄糖能促進血管內皮細胞內PKC的激活[2]，而與之相伴的是細胞內DAG水平的上升，其機制可能與高血糖促進DAG從頭合成，而激活DAG-PKC通路有關。本研究應用PKC抑制劑對HUVECs進行干預研究發現PKC參與了高濃度葡萄糖誘導的ROS的生成、NADPH氧化酶的活化以及Nox2/gp91phox和Nox4亞基的表達。因此，PKC活化是高糖環境下血管內皮細胞發生氧化應激反應的重要信號途徑之一，有望成為糖尿病條件下血管內皮功能保護和動脈粥樣硬化防治的重要靶點。本研究中，我們發現阿托伐他汀呈濃度依賴性地抑制高糖誘導的PKC的活化，提示對PKC的抑制作用是阿托伐他汀對抗高糖條件下血管內皮細胞氧化應激反應損傷的重要分子機制。

總之，本研究發現阿托伐他汀通過抑制高糖誘導PKC的活化實現其在高糖環境中抑制血管內皮細胞內Nox2/gp91phox和Nox4亞基的表達、抑制NADPH氧化酶活性及下調ROS生成，從而對抗高糖對血管內皮細胞產生的氧化應激損傷。

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Atorvastatininhibitshighglucose-inducedoxidativestressbydepressingPKCactivityinhumanumbilicalveinendothelialcells

CHAI Da-jun, NING Ruo-bing, ZHU Jiang, XU Chang-sheng, XIE Hong, LIN Jin-xiu

(DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianHypertensionInstitute,Fuzhou350005,China.E-mail:caidajun@medmail.com.cn)

AIM: To explore the effect of atorvastatin on high glucose-induced oxidative stress and underlying mechanisms in human endothelial cells.METHODSHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in medium 199 containing normal concentration of glucose (5.5 mmol/L). For high glucose treatment, glucose solution was added to the final concentration of 25 mmol/L. Reactive oxygen species (ROS) were detected by flow cytometry and confocal microscopy. The activity of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase was measured by lucigenin assay. Phosphorylated protein kinase C (PKC) and the expression levels of NADPH oxidase subunits Nox4 and Nox2/gp91phoxwere determined by quantitative real-time PCR and immunoblotting.RESULTSHigh glucose increased ROS production, NADPH oxidase activity and the expression of Nox4 and Nox2/gp91phoxsubunits. Treatment of endothelial cells with atorvastatin resulted in significant inhibition (in a concentration-dependent manner) of high glucose-induced ROS production, NADPH oxidase activation and the expression of Nox4 and Nox2/gp91phoxsubunits. PKC inhibitor showed a similar effect to that of atorvastatin on high glucose-induced oxidative stress. Furthermore, atorvastatin rapidly inhibited high glucose-induced activation of protein kinase C, an upstream activator of NADPH oxidase.CONCLUSIONPKC is involved in high glucose-induced oxidative stress in HUVECs. Atorvastatin inhibits high glucose-induced oxidative stress by depressing PKC activity in human endothelial cells.

High glucose; Oxidative stress; Statins; Protein kinase C

R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.001