脂質誘導的p62dok高表達增加肝葡萄糖異生

裴亞萍， 丁佑銘

(1湖北中醫藥大學醫院，湖北 武漢 430065; 2武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科，湖北 武漢 430060)

1000-4718(2012)09-1676-05

2012-04-05

2012-06-19

△通訊作者 Tel: 027-88041911-82218; E-mail: youmingding@yahoo.com

脂質誘導的p62dok高表達增加肝葡萄糖異生

裴亞萍1， 丁佑銘2△

(1湖北中醫藥大學醫院，湖北 武漢 430065;2武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科，湖北 武漢 430060)

目的探討p62dok表達與肝細胞葡萄糖異生間的相互關系。方法利用小鼠高脂飲食模型，觀察p62dok表達與肝組織胰島素信號轉導和葡萄糖異生調節蛋白表達間的關系；利用原代培養的小鼠肝細胞，采用基因沉默和過表達等方法，研究p62dok表達量對胰島素信號通路和葡萄糖異生的影響。采用蛋白免疫印跡法檢測蛋白和磷酸化蛋白表達。結果在高脂飲食處理的小鼠肝組織和游離脂肪酸處理的原代培養小鼠肝細胞中， p62dok的表達量顯著增加、蛋白激酶B (Akt)和叉頭框蛋白O1 (FoxO1)磷酸化程度降低，葡萄糖異生調節蛋白葡萄糖-6-磷酸酶 (G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的含量增加。沉默p62dok可增加游離脂肪酸處理的原代培養小鼠肝細胞中Akt和FoxO1磷酸化，降低G6Pase和PEPCK的含量。結論高脂可上調肝細胞 p62dok表達，并通過抑制胰島素信號轉導而調節葡萄糖異生。

p62dok； 肝細胞； 葡萄糖異生； 胰島素信號轉導

1990年，Ellis首次在哺乳動物細胞中發現了一個62 kD的蛋白質[1]。1997年，Carpino等[2]和Yamanashi等[3]先后報道該蛋白質存在于胰島素敏感細胞中，可發生酪氨酸磷酸化，具有“?？康鞍住?docking protein)的功能，推測其可能參與胰島素信號系統的調節，并將此蛋白命名為p62dok(Dok1)。其后研究表明，酪氨酸磷酸化的p62dok可募集p120 Ras GTP酶激活蛋白(p120 Ras GTPase-activating protein，p21rasGAP) 和適配器蛋白(adaptor protein)Nck并與其結合，從而參與胰島素信號系統中Ras/MAPK通路的調節，對細胞的絲裂活動產生影響[4-5]。此外，p62dok是胰島素受體酪氨酸激酶的直接底物，其受胰島素刺激而發生在酪氨酸362和398位點上的磷酸化可導致CHO細胞蛋白激酶B(protein kinase B or PKB, Akt)磷酸化的降低[6]。這一研究結果提示，p62dok可能同樣參與了對胰島素信號通路中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphotylinosital 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路的調節，因而也就可能在胰島素抵抗的發生中具有重要作用。現有研究證實p62dok具有多重作用，參與對腫瘤細胞生長與轉移、細胞分化與增殖等多種重要功能的調節[7-9]。

肝細胞胰島素抵抗是導致肝細胞葡萄糖異生的重要原因之一，在2型糖尿病的發生和發展中起著關鍵作用[10-11]。為探討p62dok對肝細胞胰島素抵抗和肝細胞葡萄糖異生的調節作用，本研究利用高脂飲食誘導小鼠肝組織或游離脂肪酸誘導原代培養肝細胞的胰島素抵抗，觀察p62dok蛋白表達與胰島素信號轉導和葡萄糖異生間的關系；同時利用基因沉默或過度表達的方法探討p62dok蛋白表達量對培養肝細胞胰島素信號轉導和葡萄糖異生關鍵調節蛋白表達的影響；旨在闡明p62dok調節肝細胞葡萄糖異生的可能作用與機制。

材 料 和 方 法

1高脂飲食小鼠模型

C57BL/6高脂飲食小鼠模型采用文獻方法[12]，雄性C57BL/6小鼠從第6周開始喂養，持續16周后進入實驗。

2小鼠肝細胞原代培養

原代肝細胞的分離與培養按文獻[13]方法進行，簡述如下：6～12周齡小鼠肝臟首先用Hanks緩沖液灌注(緩沖液A)，接著用含0.05 % 膠原酶(collagenase)和0.8 kU/L胰蛋白酶(trypsin)的Hanks緩沖液(緩沖液B)灌注；在用緩沖液B灌注期間，利用鉗子間歇性夾閉下腹腔大靜脈(lower abdominal vena cava)；然后摘取肝臟、切碎、通過系列尼龍網濾器過濾；收集細胞，利用緩沖液A洗滌3次，然后懸浮于肝細胞恢復培養液中[DMEM：含10 mg/L葡萄糖、10%胎牛血清、1 μg/L兩性霉素B (amphotericin B)、10 kU/L青霉素、50 g/L鏈霉素、10 g/L慶大霉素、1 nmol/L地塞米松、1 nmol/L胰島素]；細胞培養條件為37 ℃、95% O2和5% CO2。

3試劑、抗體和質粒

p62dokshRNA慢病毒質粒和各種抗體均購自Santa Cruz，其p62dokshRNA的發夾序列為CCGGGCCTACCGATAACCCACCTAACTCGAGTTAGGTGGGTTA-TCGGTAGGCTTTTT。原釩酸鈉(sodium vanadate)、抑酶肽(aprotinin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)等均購自Sigma。

4質粒構建與細胞病毒感染

攜帶人類全長p62dok的重組慢病毒質粒將按本實驗室常規方法構建[14]。病毒制備的方法簡述如下：將病毒質粒轉入HEK 293FT細胞中，經細胞擴增后，收集上清和細胞，經3次反復凍溶裂解細胞后，離心純化病毒，測定滴度后-80 ℃保存。病毒滴度的測定采用Cell BioLabs公司的慢病毒快速定量試劑盒(QuickTiterTMLentivirus Quantitation Kit)完成，具體操作按說明書進行。細胞病毒感染方法如下：培養肝細胞與攜帶p62dok或p62dokshRNA，及其各自相應對照(scrambled)的重組慢病毒共同培養16 h(MOI為20)，然后更換培養液，分組實驗。

5蛋白免疫印跡

實驗結束后，立即取待研究組織或細胞，用4 ℃預冷的PBS(0.01 mol/L, pH 7.4)清除血液或洗滌細胞，然后加入細胞裂解液制備組織或細胞勻漿。細胞裂解液組成如下：50 mmol/L HEPES (pH 7.6)、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L sodium vanadate、10 mg/L aprotinin和 10 mg/L leupeptin。組織或細胞溶解液15 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液冰浴20 min。Bradford法定量組織或細胞裂解液中蛋白濃度，并調整各勻漿蛋白濃度一致。然后，將組織或細胞裂解液(蛋白濃度為2 g/L)與等體積的2× SDS上樣緩沖液混合，95 ℃水浴 5 min，離心取上清行SDS/PAGE電泳。電泳條件: 堆積膠恒流10 mA，分離膠恒流15 mA。電轉移在Bio-Rad電轉移槽裝置上進行，電轉移條件為180 V、1 h。轉移后的硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜行麗春紅可逆染色以確定標準分子蛋白位置和轉移效果。免疫印跡按如下方法進行：NC膜裝入雜交袋，加封阻液(含1% BSA的TTBS)，室溫振搖1 h；去除封阻液，加入Ⅰ抗(封阻液1∶1 000稀釋抗體)，封袋，室溫振搖1 h或4 ℃過夜；除去Ⅰ抗，以TTBS洗膜10 min × 4，加入Ⅱ抗，封袋，室溫振搖1 h；去除Ⅱ抗，TTBS洗膜10 min × 4，PBS洗膜5 min；加入BCIP/NBT底物顯跡液顯色3～5 min，蒸餾水洗膜終止反應，晾干后拍照。蛋白免疫印跡至少重復3次以上。

6統計學處理

結 果

1高脂飲食增加肝組織p62dok表達和葡萄糖異生

如圖1A所示，高脂飲食可顯著增加肝組織p62dok蛋白表達(與正常飲食組比較，P<0.01)。同時，肝組織中Akt T308/S473磷酸化，以及Akt下游叉頭框蛋白O1(forkhead box O1 protein，FoxO1)S253磷酸化明顯降低，見圖1B，表明高脂飲食導致肝組織胰島素抵抗。為研究肝細胞葡萄糖異生的變化，我們檢測了葡萄糖異生調節蛋白葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的表達，結果發現這些重要調節蛋白表達量明顯升高，見圖1C；與正常飲食組比較，分別P<0.01和P<0.05，提示高脂飲食可增加肝細胞葡萄糖異生。

圖1高脂飲食對肝組織葡萄糖異生的影響

2游離脂肪酸增加肝細胞p62dok表達和葡萄糖異生

為進一步證實高脂對肝細胞p62dok表達和葡萄糖異生的影響，原代培養的小鼠肝細胞以無血清處理6 h后，予以0.5 mmol/L的棕櫚酸鹽和(或)100 nmol/L胰島素處理18 h，結果發現，棕櫚酸鹽可增加肝細胞p62dok的表達(P<0.05),見圖2A，并抑制胰島素誘導的Akt T308磷酸化和FoxO1 S253磷酸化(P<0.01)，見圖2B；同時，棕櫚酸鹽處理可以明顯增加胰島素處理時的G6Pase和PEPCK表達(P<0.01)，見圖2C。

圖2游離脂肪酸對原代培養肝細胞葡萄糖異生的影響

3p62dok基因沉默抑制肝細胞葡萄糖異生

p62dok的過度表達可抑制胰島素誘導的Akt T308磷酸化和FoxO1 S253磷酸化，增加G6Pase和PEPCK的表達，見圖3A；而p62dok的沉默可增加胰島素誘導的Akt T308磷酸化和FoxO1 S253磷酸化，抑制G6Pase和PEPCK的表達，見圖3B。上述結果提示p62dok的蛋白表達量與胰島素抵抗和肝細胞葡萄糖異生呈正相關。

圖3p62dok蛋白含量對原代培養肝細胞葡萄糖異生的影響

討 論

本實驗結果發現，高脂飲食或游離脂肪酸處理可增加p62dok表達，導致胰島素抵抗，增加葡萄糖異生；過度表達p62dok可產生與高脂飲食或游離脂肪酸處理類似的結果；而敲除p62dok可提高胰島素敏感性，降低肝細胞葡萄糖異生調節蛋白G6Pase和PEPCK的表達。這一結果提示，p62dok高表達所致的胰島素抵抗是導致脂毒性誘導肝細胞葡萄糖異生增加的重要原因之一。

高脂所導致的脂毒性在肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病及其并發癥的發生發展中具有重要意義，而胰島素抵抗在其中起到關鍵作用，其發生與胰島素信號轉導系統PI3K/Akt通路的缺陷密切相關[15]。一般認為，酪氨酸磷酸化的p62dok是一個“?？康鞍住?，對Ras/MAPK信號通路具有抑制作用[1-8]。盡管研究表明，CHO細胞中p62dok磷酸化位點突變可影響胰島素誘導的Akt磷酸化，但目前還不清楚p62dok是否對其它胰島素敏感細胞的PI3K/Akt通路產生影響。Hosooka等[12]發現，高脂飲食可導致小鼠脂肪組織p62dok的高表達，敲除小鼠p62dok可有效調節小鼠的能量代謝，提示p62dok在能量代謝中的重要作用。與此相似，我們的結果發現高脂或游離脂肪酸處理可增加肝細胞p62dok表達，且p62dok高表達與胰島素信號系統PI3K/Akt通路的抑制相一致，表明p62dok有可能參與了對該系統的調節。進一步的研究證實，當肝細胞過度表達p62dok時，Akt磷酸化和FoxO1磷酸化被有效抑制；而沉默p62dok可增加Akt和FoxO1的磷酸化；這些結果充分證實p62dok對肝細胞胰島素PI3K/Akt信號通路具有抑制作用。

肝細胞胰島素抵抗是導致肝細胞葡萄糖異生的重要原因之一[10]。正常情況下，胰島素與其細胞膜的受體結合，并引發受體磷酸化和下游蛋白的磷酸化，通過IRS1/PI3K/PDK1信號轉導而激活Akt，包括使Akt T308和Akt S473位點發生磷酸化。激活的Akt導致FoxO1 S253磷酸化，而磷酸化的FoxO1將位于細胞漿內，從而降低葡萄糖異生調節因子，如過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGC1α)、G6Pase、PEPCK等的轉錄，抑制葡萄糖異生過程[11]。在本研究中，高脂誘導的p62dok高表達導致了肝細胞的胰島素抵抗，Akt活性和FoxO1磷酸化降低，FoxO1將從胞漿轉移到胞核內，從而啟動G6Pase和PEPCK等基因轉錄，增加G6Pase和PEPCK蛋白含量，激活葡萄糖異生過程；而敲除p62dok基因則可逆轉這一變化。因此，p62dok通過對胰島素抵抗的調節而控制肝細胞葡萄糖的異生活動。

總之，本研究結果表明：高脂可誘導肝細胞p62dok高表達，并通過p62dok抑制胰島素PI3K/Akt/FoxO1信號通路，從而增加葡萄糖異生。但對高脂如何誘導p62dok增加，以及p62dok通過何種機制抑制Akt活性的等關鍵問題仍有待進一步闡明。

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Lipid-inducedp62dokup-regulationenhanceshepaticgluconeogenesis

PEI Ya-ping1, DING You-ming2

(1UniversityHospital,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China;2DepartmentofHepatobiliary&LaparoscopicSurgery,People’sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China.E-mail:youmingding@yahoo.com)

AIM: To investigate the potential role of p62dokin the regulation of hepatic gluconeogenesis.METHODSThe expression of p62dok, insulin signaling transduction, and hepatic gluconeogenesis were investigated in the liver tissues of mice treated with high-fat diet (HFD) and in cultured mouse hepatocytes treated with free fatty acid (FFA). The experiments of gene silencing and overexpression were conducted to observe the effects of p62dokon insulin signal transduction and hepatic gluconeogenesis in cultured mouse hepatocytes. Western blotting was used to detect the protein levels and the phosphorylation statue.RESULTSThe increased p62doklevels were found in the liver tissues from HFD-treated mice and FFA-treated hepatocytes. Meanwhile, phosphorylation of Akt and forkhead box O1 protein (FoxO1) was were decreased and the expression of glucose-6-phosphatase (G6Pase) and phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) was increased. Silencing ofp62dokin cultured hepatocytes treated with FFA induced the increase in phosphorylation of Akt and FoxO1, and decrease in the protein levels of G6Pase and PEPCK.CONCLUSIONUp-regulation of p62dokinduced by HFD or FFA enhances hepatic gluconeogenesis via inhibiting insulin signal transduction.

p62dok; Hepatocytes; Gluconeogenesis; Insulin signal transduction

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.024