一株熒蒽降解菌的篩選及其特性研究＊

隋曉斌，王麗平，王安利

（1.華南師范大學生命科學學院 廣州 510631；2.中國環境科學研究院河口與海岸帶創新基地 北京 100012）

一株熒蒽降解菌的篩選及其特性研究＊

隋曉斌1，王麗平2，王安利1

（1.華南師范大學生命科學學院 廣州 510631；2.中國環境科學研究院河口與海岸帶創新基地 北京 100012）

從天津新港潮間帶沉積物中篩選出一株能以熒蒽為唯一碳源和能源且生長良好的菌株Y1，并對菌株特性進行了系統研究。實驗結果發現菌株Y1為革蘭氏陰性菌，適合在低鹽度（＜1%氯化鈉）的環境中生長，最適p H值為6～7，最適的生長溫度為25℃～28℃。該菌株對鋅、鉛、銅、鉻和低濃度的鎘均有抗性，但對高濃度的鎘十分敏感；菌株Y1對常見抗生素卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和利福平具一定抗性，但對四環素較敏感。通過對菌株Y1的16 S r DNA測序和序列比對，并結合其生理生化特性確定其為Sediminibacterium sp.，歸屬于鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria）。Y1在10天內對熒蒽的降解率為14%，且GST酶在Y1降解熒蒽的過程中起著重要的作用。

微生物降解；多環芳烴；潮間帶

多環芳烴（poly－aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類高分子量有機化合物的統稱。這類化合物含有兩個或兩個以上苯環，極難溶于水，在環境中很難被降解。一些研究表明PAHs具有潛在的毒性，表現在它對生物體具有致癌性、致畸性和致突變性。目前去除環境中的多環芳烴的方法有化學方法、物理方法和生物降解法。物理方法和化學方法雖然處理十分快速，但容易造成二次污染；生物降解方法即經濟、安全、殘留又少，逐漸得到人們的認可。其中微生物由于生長迅速、變異率高，很容易產生土著的多環芳烴高效降解菌株［1－6］。

近幾年來，渤海灣周邊地區經濟迅速發展的同時，也帶來了嚴重的環境問題，其中一些污染物已經超出了本地環境自身的調節能力，對生態系統健康構成一定的威脅，阻礙了渤海灣經濟的健康可持續發展。PAHs是渤海灣潮間帶沉積物中的主要污染物之一，且沿岸區含量較高［7］，其中含4個苯環的熒蒽是主要的PAHs污染物之一［8］。渤海灣潮間帶中高濃度的熒蒽可能會引起本地微生物菌株發生突變而形成可以高效降解熒蒽的菌體。因此，我們從受PAHs污染嚴重的天津新港區潮間帶采集表層沉積物以多環芳烴熒蒽為唯一能源和碳源，篩選優勢降解菌株，并對其生理生化特性、生長特征和降解效能等進行了系統研究，以期為以后的生物原位修復提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種來源和培養基

1.1.1 樣品來源

從天津新港區潮間帶采集表層沉積物，放于經紫外消毒過的自封袋中，4℃保存待用。

1.1.2 培養基

營養培養基（g/L）：葡萄糖10，牛肉膏3，蛋白胨5。

無機鹽培養基（g/L）：硝酸銨1.0；磷酸氫二鉀0.5；磷酸二氫鉀0.5；七水硫酸鎂0.5；氯化鈉1.0；氯化鈣0.1；三氯化鐵0.02；酵母膏0.05；p H值7.0～7.2。固體培養基中加入2%瓊脂。用丙酮配置20 mg/m L熒蒽母液，0.22μm濾膜除菌，加入滅菌無機鹽培養基中作為唯一碳源。

1.2 熒蒽降解菌的篩選、純化

稱取5 g沉積物樣品，放入盛有100 m L熒蒽無機鹽液體培養基的250 m L三角瓶中，放到搖床上30℃、150 r/min避光富集培養，5天后直接轉移10 m L培養液至另一新的含熒蒽無機鹽培養基中，之后采用逐步提高熒蒽濃度的方法（最終為100 mg/L），轉移5次后獲得富集培養物。

將富集培養物經系列稀釋后，在含熒蒽的固體培養基上反復劃線分離，于恒溫培養箱中28℃避光倒置培養，直至平板上出現單個菌落，挑選生長最好的優勢菌落（命名為Y1）進行進一步的研究。

1.3 形態觀察

1.3.1 顯微鏡觀察

采用光學顯微鏡（Olympus）進行革蘭氏染色，觀察菌體形態。

1.3.2 掃描電鏡觀察

在無菌條件下挑取適量菌體立刻用以p H值7.4磷酸緩沖液配制的2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，然后經過乙醇系列脫水、常規臨界點干燥、樣品粘貼和真空鍍膜后，在掃面電鏡下觀察。

1.4 菌株生理生化指標的測定

對菌株進行系列生理生化特性試驗，主要包括甲基紅（M.R.）試驗、乙酰甲基醇（V.P.）試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、硫化氫試驗以及吲哚試驗等，每組兩個平行。

1.5 環境條件對菌株生長的影響

1.5.1 溫度對菌株生長的影響

將所篩選菌株活化24 h后，接種于營養培養液中，分別在4℃、20℃、28℃、30℃、37℃和45℃的溫度下培養24 h，用722分光光度計測定波長600 nm時的光密度值（OD600），每組兩個平行。

1.5.2 p H值對菌株生長的影響

用1 mol/L的氫氧化鈉和1 mol/L的鹽酸將營養培養基的p H值分別調至4、5、6、7、8和10。將待測菌株活化24 h后接入上述培養液中，28℃培養24 h，用722分光光度計測定不同p H值條件下菌懸液的OD600值，每組兩個平行。

1.5.3 鹽度對菌株生長的影響

將菌株活化24 h后，分別接種于含0、1%、2%、3%、5%、8%和10%氯化鈉（NaCl）的營養培養基中，28℃下培養24 h，用722分光光度計測定鹽度下菌懸液的OD600值，每組兩個平行。

1.6 對抗生素和重金屬的抗性實驗

取0.1 m L制備好的菌懸液接種于固體培養基中，用無菌玻璃刮涂抹均勻，將滅菌濾紙浸入供試試劑中，用無菌鑷子夾取浸藥濾紙片（提前將濾紙瀝干），分別平鋪于含菌體平板上，并做好記號，28℃下培養72 h后，觀察濾紙片周圍有無抑菌圈產生，每組兩個平行。

選擇5種常用抗生素進行敏感試驗，其濃度為：卡那霉素，10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L；氨芐青霉素，100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L；鏈霉素，10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；四環素，10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；利福平，10 mg/L、60 mg/L和100 mg/L。

金屬離子及其濃度如下：鎘（Cr6＋），10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；鋅（Zn2＋），100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L；鉛（Pb2＋），100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L；銅（Cu2＋），10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L；鉻（Cd2＋），20 mg/L、50 mg/L和100 mg/L。

1.7 菌株DNA的提取和PCR擴增

挑取適量菌株于100μL無菌去離子水中，采用水煮法快速提取細菌基因組DNA，離心取上清液作為PCR擴增的待用模版，用于16 S r DNA基因的擴增。所用引物為27 F（5’－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3’）和1 492 r（5’－GGC TACCTTGTTACGACTT－3’），反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，30個循環，最后72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測，將純的樣品送至上海英俊公司回收并測序。將16 S r DNA的測序結果輸入基因庫（GenBank）中進行序列比對。

1.8 降解效能的測定

將菌株在液體營養培養基中活化24 h后，取0.6 m L菌液至裝有12 m L無機鹽液體培養基的三角瓶中，然后加入12μL熒蒽母液，采用液相色譜（HPLC）測定培養瓶中熒蒽初始濃度。然后將3個平行樣品放在150 r/min、28℃振蕩培養箱中培養。10天后，采用液相色譜（HPLC）測定培養液中熒蒽濃度的變化。

1.9 菌株蛋白質含量和GST酶活性的測定

菌株蛋白質采用考馬斯亮蘭法測定；GST酶活性采用GST酶試劑盒測定（南京建成生物工程研究所），該試劑盒是通過檢測GSH濃度的高低來反應GST活力的大小，GSH（底物）濃度越低則GST活力越大。

2 結果

2.1 菌株的形態特征和生理生化指標

菌株Y1為革蘭氏陰性菌，在固體營養培養基上菌株淡黃色、圓形、不透明和邊緣規則；在以熒蒽為唯一碳源的固體無機鹽培養基上菌株呈白色、半透明和邊緣規則。在掃描電鏡下菌體細胞為桿狀（圖1），其部分生理生化特征見表1。

圖1 菌株Y1個體形態的掃描電鏡觀察

表1 菌株Y1的部分生理生化特征

2.2 環境條件對菌株生長的影響

（1）溫度對菌株生長的影響。由圖2可知，菌株Y1在不大于20℃和不小于37℃條件下生長較差，而在25℃～28℃范圍內生長最好。

（2）鹽度對菌株生長的影響。由圖3可見，隨著鹽度的增加，菌株Y1生長狀況逐漸變差，在NaCl濃度為1%時，生長較差；當NaCl濃度達到3%時細菌幾乎不能生長。因此菌株Y1在小于1%NaCl的低鹽度環境下生長較好。

（3）p H值對菌株生長的影響。圖4表明，菌株Y1在p H值小于5和p H值大于9的條件下幾乎不能生長，而在p H值6～8范圍內生長良好，其中在p H值6～7之間生長最好。

2.3 菌株對抗生素和重金屬的抗性

2.3.1 抗生素試驗

菌株Y1對5種常見抗生素的敏感試驗結果發現：在卡那霉素（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）、鏈霉素（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）、氨芐青霉素（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）和利福平（10 mg/L、60 mg/L、100 mg/L）4種抗生素的各個濃度都沒有出現抑菌圈，說明該菌株對這4種抗生素具一定抗性；四環素（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）各個濃度都出現了抑菌圈，說明菌株對這種抗生素比較敏感。

2.3.2 重金屬試驗

菌株Y1對5重金屬離子抗性實驗結果說明：Zn2＋（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）、Cu2＋（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）、Cd2＋（10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L）和Pb2＋（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）4種金屬測定的濃度中都沒有抑菌圈出現，說明該菌株對這4種離子有耐受性；在Cr6＋試驗中，濃度為10 mg/L時沒有抑菌圈出現，但在濃度升至20 mg/L和50 mg/L的試驗時出現了抑菌圈，說明菌株Y1對低濃度的Cr6＋有抗性，但對高濃度的Cr6＋很敏感。

2.4 16SrDNA基因的擴增和序列分析

利用細菌16 S r DNA引物27 f和1 492 r進行擴增，獲得1 500 bp左右大小的PCR產物，符合預期產物長度，純化產物并且測定產物的序列，將測序結果輸入GenBank中進行BLAST比對，發現該菌株與Sediminibacterium sp.的同源性為95%。

2.5 菌株對熒蒽的降解率試驗

試驗結果如表2所示，3個平行樣品經過10天培養后熒蒽濃度分別降低了16%、14%和18%。

表2 菌株Y1對熒蒽的降解效能

2.6 熒蒽對菌株Y1蛋白質含量和GST酶活性的影響

取活化24 h后的菌液分別接種到營養液體培養基和以熒蒽為唯一碳源的無機培養基中，培養3 d后，取適量菌液，超聲波破碎后進行菌體蛋白質含量和GST酶活性的測定，結果如表3所示。由表3可見，經熒蒽誘導培養后，其菌體蛋白質含量和GST酶活性都明顯提高。

表3 熒蒽降解菌液蛋白質含量和GST酶活性測定結果

3 討論與結論

從受污環境中分離、篩選出高效降解菌株，是生物修復受污環境的第一步，也是關鍵的一步［9］，了解其生物學特性是利用降解性微生物進行原位修復的必要理論基礎。筆者從天津新港區渤海灣潮間帶篩選出一株具有降解多環芳烴熒蒽能力的土著優勢菌株，并對其生長和降解特性進行了研究。環境條件對菌株生長的影響為摸索菌株的培養條件及其在環境中的適應性提供實踐依據。筆者所篩選菌株Y1，在小于1%NaCl、25℃～28℃和p H值6～8生長最好，同時對常見抗生素和重金屬都具一定抗性，10天內對熒蒽的降解率在14%～18%。天津新港高潮帶鹽度較低，p H值一般在7～8之間，因此初步認為本次所篩選熒蒽降解菌株Y1較適合在春末夏初和秋季（25℃～28℃）用于天津新港潮間帶多環芳烴污染的微生物原位修復，但其在自然環境中的生長狀況和降解效能仍待于進一步研究。

rRNA廣泛存在于真核和原核生物中，功能穩定，由高度保守區和可變區組成。將待測菌株提取其遺傳物質，經測序、BLAST比對，并結合其生理生化特征，對菌株加以鑒定是目前應用最為普遍的鑒定方法。筆者在對所篩選菌株進行一系列生理生化試驗基礎上，采用16 S r RNA同源性序列分析方法鑒定所篩選菌株的種類。16 S r RNA大小為1 500 bp左右，所代表的信息量能反映生物界的進化關系。筆者采用27 f和1 492 r引物對擴增所提取菌株總DNA，經過克隆測序，將序列正確拼接后獲得1 620 bp的遺傳序列，經BLAST比對后菌株被鑒定為Sediminibacterium sp.，歸屬于鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria）。為進一步確定菌株Y1對熒蒽的降解能力，我們測定了10天內該菌株對熒蒽的降解效能。采用高效液相色譜（HPLC）測定熒蒽濃度的變化，結果證實菌株Y1對熒蒽有較高的降解能力。另外，研究表明：在PAHs降解過程中，谷胱甘肽轉移酶（GST）在其中起著重要的作用，曾有人將GST酶作為PAH降解菌存在的分子探針［10－11］。筆者對菌株Y1的蛋白含量和GST酶活性進行了檢測，結果發現在培養基中加入熒蒽后，菌體的蛋白含量和GST酶活性明顯提高，表明菌體產生了大量與降解多環芳烴相關的蛋白和酶類。

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國家基礎研究發展規劃項目（“973”項目）（2007CB407306）.