順鉑與氯霉素聯用增強對人肺腺癌A549細胞的抑制作用

錢海洪，胡義德

順鉑與氯霉素聯用增強對人肺腺癌A549細胞的抑制作用

錢海洪，胡義德

（昆明醫科大學第六附屬醫院腫瘤科，云南玉溪653100）

目的體外觀察順鉑和氯霉素對人肺腺癌A549細胞的相互作用。方法采用MTT法，利用中效原理判定聯合應用順鉑及氯霉素對人肺腺癌A549細胞的效應。結果順鉑與氯霉素聯用可以明顯抑制人肺腺癌A549細胞的生長，兩藥單用和聯用時隨著藥物濃度增加，其效應也增加；兩藥聯用時的中效濃度明顯小于兩藥單獨使用時的中效濃度（順鉑減少43.8%，氯霉素減少79.1%）；兩藥大劑量合用時為拮抗效應（CI＞1），小劑量合用時為協同效應（CI＜1）；并且兩藥合用時的效應與給藥的時間先后次序無關（P＞0.05）。結論順鉑與氯霉素的聯用可以明顯抑制人肺腺癌A549細胞的生長，兩藥聯用時的中效濃度較單用時明顯減小；上述兩種藥合用時大劑量為拮抗，小劑量為協同；兩藥合用時的效應與給藥的時間先后次序無關。

肺腺癌A549細胞；順鉑；氯霉素；中效原理；合用指數

腫瘤化療作為全身性治療的手段，它在治療中具有手術和放療不可替代的地位，傳統的化療藥物療效不高，毒副反應較大。為了進一步提高化療療效，我們在體外觀察用順鉑和氯霉素兩種藥物單用或合用時對人肺腺癌A549細胞的相互作用，并且采用Chou Talalay聯合指數法（即中效原理）[1]判斷兩種藥物相互作用的效果。

資料與方法

一、材料

1．細胞培養：人肺腺癌A549細胞系由中科院上海細胞生物研究所提供。用10%新生牛血清RPMI-1640培養液（內含0.11%青霉素、鏈霉素）培養細胞，并置37℃、5%CO2培養箱內孵育。

2．藥物：注射用順鉑（Cisplatin，CDDP）使用時配制成終濃度為0.333、0.666、1.332、2.664和5.328μmol/L 5種濃度，氯霉素注射液（Chloramphenicol，CAP）使用時配制成終濃度為30.947、61.894、123.788、247.576和495.152μmol/L，5種濃度。

二、方法

1．用MTT法[2]檢測藥物效應：將處于對數生長期的肺腺癌A549細胞制成1.5×104個細胞/ml的懸液，每孔200μl加入96孔培養板內。實驗設各種藥物濃度試驗組及腫瘤細胞陰性對照組和空白組（每組設3個復孔），將兩種單藥的5種不同濃度分別加入96孔板內，每孔加藥量20μl，兩藥合用比例為1∶1方案，每孔加藥總量仍為20μl（每種單藥劑量濃縮1倍，各加10μl）。置37℃、5%CO2培養箱內培養3d，用TECAN自動酶標儀測定OD490值。

2．兩藥合用時間先后次序依賴關系：實驗同時設同時給藥組、先加CDDP24h后再加CAP組和先加CAP24h后再加CDDP組。培養3d MTT法測定OD490值。

3．結果判定方法：根據中效方程式fa/fu＝（D/Dm）m，兩邊取對數得lgfa/fu＝mlgD－mlgDm。設Y＝lgfa/fu，X＝lgD，a＝－mlgDm，b＝m，帶入上述方程式中得Y＝bX+a。其中fa為細胞抑制率＝1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值；fu為細胞生存率＝實驗組平均OD值/對照組平均OD值；D為藥物濃度；Dm為中效濃度即IC50。再根據lgDm＝－a/b就可以算出兩種藥物單用及合用時各自的中效濃度Dm。然后可計算出兩藥合用時在各種效應時的合用指數CI＝D1/Dx1+D2/Dx2+α（D1D2/Dx1Dx2），D1、D2為合用時產生X效應時兩藥各自濃度，Dx1、Dx2為兩藥單獨使用時各自所需濃度，α＝0為兩種相互排斥性藥物，α＝1為兩種相互非排斥性藥物。CI＜1協同，CI=1相加，CI＞1拮抗[3]。

4．統計學處理利用統計學軟件SPSS10.0進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05具有統計學意義。

結果

一、兩藥單用及合用時不同濃度的效應兩種藥單用及合用時隨著藥物濃度增加其效應也增加，見表1。按中效方程式計算m、Dm及γ，見表2。再計算出兩藥合用在不同效應時的合用指數CI，進而判斷兩藥在不同效應時各自所需藥物濃度之間相互作用是協同、相加還是拮抗。因為CDDP與CAP，2藥作用機理不同，α＝0。結果見表3；以效應fa為橫坐標，CI為縱坐標作量效曲線，見附圖。

二、兩藥合用時間先后次序依賴關系，見表4。

討論

順鉑是治療肺癌中最常用的化療藥物之一，屬于細胞周期非特異性藥物，主要作用靶點是增殖細胞的DNA，有類似烷化劑雙功能基團的作用，可和細胞內的堿基結合，使DNA分子鏈內和鏈間交叉鍵聯，從而使DNA失去功能，不能復制；高濃度時也抑制DNA和蛋白質的合成。順鉑除了與核DNA相互作用外，線粒體DNA（mtDNA）也是其重要的作用靶點。順鉑可引起肺腺癌A549細胞凋亡已被證實[4,5]，并且上一階段試驗結果表明經順鉑作用后肺腺癌A549細胞中細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ（CoxⅠ）、核糖體12SrRNA基因以及半胱氨酸轉運RNA（tRNA-Cys）、天冬酰胺轉運RNA（tRNA-Asn）基因表達顯著上調，由此推測線粒體氧化磷酸化功能的增強是癌細胞對化療藥物的自然反應過程[6]。氯霉素誘導細胞凋亡的作用機理主要有以下幾個方面：①抑制線粒體蛋白質的合成；氯霉素通過與線粒體核糖體的70S亞基相結合而抑制線粒體蛋白質的合成，長時間的蛋白質合成障礙會導致能量的匱乏，線粒體膜穩定性的紊亂，最終引起凋亡[7]；②對線粒體呼吸鏈的影響，Douglas[8]經實驗證明氯霉素可以明顯降低復合體IV的水平，而對復合體II/III幾乎沒有影響，從而抑制線粒體呼吸鏈的功能；③cyt-c增多，氯霉素可以使cyt-c的合成和釋放增加[9]，cyt-c的增加又可以誘導凋亡的發生。

在本實驗中，從表1可以看出，順鉑和氯霉素單獨應用和聯合應用時隨著藥物濃度增加，其效應也增加；這兩種藥在體外合用后，它們對肺腺癌A549細胞的抑制作用明顯加強，并且聯用時的中效濃度比單用時要小得多（見表2）。其中CDDP單用時Dm＝2.897μmol/L，合用時Dm＝1.629μmol/L，合用比單用時減少43.8%；CAP單用時Dm＝724.436μmol/L，合用時Dm＝151.462μmol/L，合用比單用時減少79.1%。這充分說明CDDP與CAP聯合用藥在體外對肺腺癌A549細胞只需小劑量就達到高效應，同時也使藥物不良反應減少。

從兩種藥物合用時的量效曲線也可以看出，當效應fa＝0.55時（即CDDP＝2.461μmol/L，CAP＝228.72μmol/L），其CI為1，說明兩種藥在該效應時其相互作用為相加；當fa＞0.55時（即CD-DP＞2.461μmol/L，CAP＞228.72μmol/L），CI＞1，為拮抗作用效應；當fa＜0.55時（即CDDP＜2.461μmol/L，CAP＜228.72μmol/L），CI＜1，為協同作用效應。

表1 兩種藥物單用及合用時不同濃度（μmol/L）時的效應（fa）

表2 兩種藥物單用及合用時的m、Dm及γ

表3 兩種藥物在不同濃度時的合用指數

附圖CDDP與CAP合用時的量效曲線

表4 兩藥合用時用藥時間先后次序依賴關系

從表4經單因素方差分析結果為：F＝0.564，P＝0.583＞0.05，并認為同時加藥組、先加CDDP組和后加CDDP組，3組間在統計學上無顯著差異，也就是兩藥合用時的效應與給藥的時間先后次序無關。

順鉑與氯霉素聯合應用時，尤其是在藥物濃度較小時，對肺腺癌A549細胞具有協同殺傷作用，說明兩藥在聯合應用時，其抑制肺腺癌A549細胞生長的效果要明顯強于單獨用藥，其作用機制有待于進一步的研究。同時順鉑和氯霉素的聯合用藥也為腫瘤的臨床用藥開拓了新的思路，有望能進一步提高化療療效和降低化療藥物的毒副作用，但要真正用于臨床還需要更多的相關研究。

［1］CHOU TC，TALALAY P.Quantitative analysis ofdose-ef

fect relationship：the combined effects of multiple drugs on enzymeinhibitions[J]．ADV Enzyme Regul，1984, 22：37.

［2］湯為學，駱云鵬，王應雪，等.人實體瘤抗癌藥物敏感試驗MTT法的建立[J]．重慶醫科大學學報，1992，17（21）：103.

［3］張連本，張連陽.腫瘤化學治療敏感性與抗藥性[M].成都：四川科學技術出版社，1994:348.

［4］劉文哲，李金瀚.順鉑誘導A549細胞凋亡的研究[J]．中國肺癌雜志，2002，5（4）：254.

［5］劉文哲，胡義德.人肺腺癌A549/DDP耐藥細胞減弱順鉑誘導的細胞凋亡[J]．癌癥，2000，19（4）325.

［6］孫恒文，胡義德，錢頻等.順鉑誘導肺腺癌A549細胞線粒體基因組及凋亡相關基因的差異表達[J].解放軍醫學雜志，2004，29（12）：1049-1051.

［7］KROEMER G,ZAMZAMI N,SUSIN S.Mitochondrial control ofapoptosis[J]．ImmunologyToday,1997,18：44-51.

［8］DOUGLAS R.Inhibition of mitochondrial protein synthesis results in increased endothelial cell susceptibility to nitric oxide-induced apoptosis[J]．Biochemistry，2002，99(10)：6643～6648.

［9］SIEMENS T,NICHOLS D,ZITOMER R.Effect of mitochondrial functions on synthesis of yeast cytochrome C[J].Journal ofBacteriology，1980，142：499-507.

The interaction between cisplatin and chloramphenicol on human lung adenocarcinoma cell line A549.

QIAN Hai-hong,HU Yi-de
（Department of Oncology，Sixth Affiliated Hospital，Kunming Medical College，Yuxi,Yunnan 653100，China）

ObjectiveTo observe the interaction between cisplatin and chloramphenicol on human lung adenocarcinoma cell line A549.MethodsThe anticancer effect of the drugs was detected with MTT.The median-effect principle was used.ResultsThe combination of cisplatin and chloramphenicol significantly inhibited the growth of human lung adenocarcinoma cell line A549.Anticancer effects of the individual and combined drugs enhanced as drug concentration increased.The 50%inhibited concentration of each drugs in combination was lesser than the concentration of each individual drugs.(Cisplatin decreased of 43.8%,Chloramphenicol decreased of 79.1%).The combination of the two drugs at higher concentration the CI was more than 1,and the combinations at lower concentration the CI was less than 1.The sequence of administration did not influence the anticancer effects (P＞0.05).ConclusionThe combination of cisplatin and chloramphenicol significantly inhibited the growth of human lung adenocarcinoma cell line A549.The 50%inhibited concentration of each drugs in combination was lesser than the concentration of each individual drugs.The combined drugs interaction was antagonistic at higher concentration and synergistic at lower concentration.The sequence ofadministration did not influence the anticancer effects.

Lung adenocarcinoma cell line A549；Cisplatin；Chloramphenicol；Median-effect principle；Combination index

R734.2

A

1006-4141（2012）04-0346-04

2012－04－10

錢海洪（1974～）男，主治醫師，碩士生，主要從事腫瘤細胞線粒體功能干預對其化療敏感性進行調控的研究工作。

胡義德，男，主任醫師，博士后，教授，碩士生導師。