肺金生方對(duì)Lewis肺癌小鼠VEGF-C、nm23表達(dá)的影響

龐德湘 周 楠 邊至慰 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科 杭州310053

原發(fā)性支氣管肺癌（簡(jiǎn)稱肺癌）是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，第三次全國(guó)居民死因調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)肺癌的病死率與30年前相比上升了46.5%，已成為我國(guó)首位惡性腫瘤死亡原因[1]。肺金生方由《金匱要略》經(jīng)典方澤漆湯結(jié)合現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果化裁而成，臨床治療肺癌患者療效顯著[2]，近年有關(guān)于其療效的臨床報(bào)道，但有關(guān)其抗腫瘤機(jī)制的研究尚為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察肺金生方對(duì)Lewis 肺癌小鼠VEGF-C、nm23表達(dá)的影響，探討肺金生方抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制及途徑，從而為臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 C57BL/6小鼠60只，雄性，5～6周齡，體質(zhì)量18～20g，清潔級(jí)，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Lewis荷瘤鼠：購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥 物 肺金生方，由澤漆30g，前胡10g，人參、桂枝各9g，紅豆杉枝8g，蜂房15g，石見(jiàn)穿30g 等組成，按《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算小鼠的等效劑量，肺金生方低、中、高劑量分別相當(dāng)于臨床成人用量的5、10、20 倍，常規(guī)水煎，取煎液濃縮，濃縮成0.925、1.85、3.7g/mL。滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器 兔抗鼠VEGF-C、VEGFR-D、P53、nm23、PCNA 單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，多聚賴氨酸、SP-9001、DAB試劑盒購(gòu)于杭州達(dá)文生物有限公司。超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），電子顯微鏡（日本，Nikon.E80i型），多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國(guó)Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus）；切片機(jī)（德國(guó)萊卡RM2015）；離心機(jī)（北京離心機(jī)廠LDZ5-2 型）；干燥箱（日本三洋MIR-153型）；恒溫水浴箱（江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模及分組 將Lewis 荷瘤小鼠脫頸椎處死，放入75%酒精中浸泡消毒10min，在超凈工作臺(tái)上分離瘤體。取其中生長(zhǎng)良好、無(wú)壞死的腫瘤組織，用生理鹽水沖洗后剪碎，經(jīng)0.25%胰蛋白酶室溫下消化5min，過(guò)300目尼龍網(wǎng)制成小鼠Lewis 肺癌無(wú)菌單細(xì)胞懸液，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL；臺(tái)盼藍(lán)染色后示:活細(xì)胞比例＞95%，取60 只C57BL/6小鼠，將配制好的細(xì)胞懸液接種至每只小鼠右腋皮下，每只接種0.2mL。隨機(jī)分生理鹽水組、CTX組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和CTX加中藥中劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法 接種24h 后給藥，生理鹽水組予生理鹽水0.2mL灌胃，1天1次，共14天；中藥低、中、高劑量組予相應(yīng)濃度中藥肺金方0.2mL灌胃，1天1次，共14天；CTX 組予CTX 20mg/kg，腹腔內(nèi)注射，1天1次，第1～5天，同時(shí)予生理鹽水10mL/kg 灌胃，1天1次，共14天。CTX 加中藥組予中藥中劑量0.2mL 灌胃，1天1次，共14天，同時(shí)給予CTX 20mg/kg，腹腔內(nèi)注射，1天1次，第1～5天。

2.3 標(biāo)本采集 灌胃14天后，動(dòng)物禁食不禁水12h，脫頸處死后，剝?nèi)×鰤K，10﹪甲醛固定。

2.4 檢測(cè)小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù) 取肺，光鏡觀測(cè)肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。

2.5 瘤塊及瘤周圍組織VEGF-C、nm23 檢測(cè) 采用免疫組化SP法，一抗為兔抗鼠單克隆抗體，1∶100 稀釋，生物素化二抗為山羊抗小鼠IgG，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，VEGF-C 為腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，nm23以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色判為陽(yáng)性。在10×40 倍高倍鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥25%為陽(yáng)性表達(dá)。采集免疫組織化學(xué)染色圖像，用Image-Pro Plus 分析軟件進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野測(cè)定瘤組織中陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較用SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肺金生方對(duì)Lewis 肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響

除中藥低劑量組外，各處理組肺轉(zhuǎn)移數(shù)與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺加中藥組與中藥各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥中、高劑量組與中藥低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明肺金生方對(duì)Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響與其濃度有一定關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1 各組Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)比較（）個(gè)

表1 各組Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)比較（）個(gè)

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.01；與中藥高、中、低劑量組比較，△P＜0.01；與中藥低劑量組比較，▲P＜0.01

3.2 肺金生方對(duì)Lewis 肺癌移植瘤細(xì)胞VEGF-C、nm23蛋白表達(dá)的影響 與生理鹽水組比較，中藥各劑量組及CTX、CTX 加中藥組均能降低VEGF-C 表達(dá)（P＜0.05、P＜0.01）；中藥中、高劑量組、CTX 加中藥組均能提高nm23 表達(dá)（P＜0.01），中藥中、高劑量組的nm23表達(dá)又高于CTX加中藥組（P＜0.01），見(jiàn)表2。

4 討論

肺金生方來(lái)源于《金匱要略》經(jīng)典方澤漆湯，方中以澤漆為君，功專消痰行水，人參助澤漆逐水消痰，扶正固本，桂枝、前胡、生姜溫陽(yáng)化飲，降氣消痰。人參、甘草健脾以扶正氣，佐黃芩以清泄水飲久留所化之郁熱，加用蜂房、紅豆杉散結(jié)消腫，共奏補(bǔ)肺散結(jié)，化氣消痰，止咳平喘之功。

表2 肺金生方對(duì)Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞VEGF-C、nm23蛋白表達(dá)的影響（）

表2 肺金生方對(duì)Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞VEGF-C、nm23蛋白表達(dá)的影響（）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CTX+中藥組比較，△P＜0.01

VEGF-C 被認(rèn)為在腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移中起著重要作用，具有促進(jìn)淋巴管、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用，可通過(guò)促進(jìn)腫瘤新生淋巴管形成及淋巴管擴(kuò)張，并參與人體多種生理及病理過(guò)程[3]。nm23 基因是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因之一，nm23 基因引起許多哺乳類動(dòng)物腫瘤細(xì)胞過(guò)于表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。若nm23缺失，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)期存活[4]。本研究結(jié)果表明，中藥肺金生方各劑量組均能降低VEGF-C 表達(dá)（P＜0.01、P＜0.05），而中藥肺金生方中、高劑量組、CTX 加中藥組均能提高nm23的表達(dá)（P＜0.01），中藥肺金生方中、高劑量組的nm23表達(dá)水平較CTX加中藥組更高（P＜0.01）。本組結(jié)果表明肺金生方可以抑制Lewis 肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與降低VEGF-C 表達(dá)和提高nm23的表達(dá)有關(guān)，但其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.第三次全國(guó)死因調(diào)查主要情況［J］.中國(guó)腫瘤，2008，17（5）:344-345.

［2］周少玲，龐德湘.肺金生方治療肺虛痰阻型非小細(xì)胞肺癌29例臨床觀察［J］.浙江中醫(yī)雜志，2008，43（6）:328-329.

［3］Hirakawa S，Lawence FB，Kodama S，et al.VEGF-C induced lym-phangiog-enesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metasis to distant sites［J］.Blood，2007，109（2）:1010-1017.

［4］侯治富，楊紹娟.基因治療的研究概況［J］.中國(guó)腫瘤臨床，1997，24（8）:619.