核磷蛋白小分子抑制劑NSC348884對肝癌細胞HepG2的體外抑制作用

張 潔，趙浩亮，賀杰峰，李輝宇

山西醫科大學第一醫院普通外科，太原030001

原發性肝癌是世界上最高發的癌癥之一，早期診斷率低，術后復發率高，一經發現多為晚期［1-2］，因此尋求新型有效的抗肝癌藥物具有重要意義。NSC348884是Qi等［3］于2008年首次報道的一種核磷蛋白 (nucleophosmin，NPM)小分子抑制劑。它能特異性破壞NPM氨基末端的疏水口袋結構，從而抑制NPM寡聚物的形成，破壞其在癌細胞中的異常功能。該研究表明NSC348884可在多種癌細胞系中抑制細胞的增殖，包括前列腺癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、淋巴癌。因此，NSC348884將可能成為抗癌治療的新型藥物。最新研究表明，NPM在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中呈高表達，可能是潛在的HCC標志物［4］。NPM將可能成為肝癌治療的新靶點，而關于NSC348884對肝癌細胞的作用尚少有報道。本研究旨在觀察NSC348884對肝癌細胞HepG2體外生長的抑制效應，并探討其作用機制。

材料和方法

細胞培養HepG2肝癌細胞株 (購自中國科學院)培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(另加入青霉素50 U/ml和鏈霉素60 μg/ml)中，溫度37℃，含5%的CO2，選用對數生長期的細胞進行實驗。

噻唑藍檢測細胞增殖HepG2細胞以5×104/ml的濃度接種于96孔板中，每孔200 μl，設3個復孔。培養24 h后更換NSC348884(美國Sigma公司)終濃度為0、0.01、0.1、1、2、5、10、40、50 μmol/L 的10%胎牛血清培養液。培養4 d后，加入噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，4 h后，棄培養液，加入二甲基亞砜100 μl，培育5 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度。實驗組按下列公式計算細胞存活率:存活率 (%)=加藥細胞平均吸光度值/對照細胞平均吸光度值×100%，繪制細胞增殖曲線圖。

免疫印跡法檢測寡聚物及單體的表達變化0 μmol/L(空白對照)、2 μmol/L NSC348884 分別處理肝癌細胞HepG2，24 h后胰酶消化，收集細胞。按核蛋白提取試劑盒方法提取核蛋白。Bradford法進行蛋白質定量。取50 μg蛋白質分別做濃度為15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (native polyacrylamide gel electrophoresis，native PAGE)，電泳完畢將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，小牛血清封閉2 h，兔抗人NPM一抗 (CST公司)1∶1000室溫孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗 (美國Santa Cruz Biotechnology公司)室溫孵育1 h，最后使用二氨基聯苯胺試劑顯色 (美國DAKO公司)。

流式細胞術檢測細胞凋亡率0、1、2 μmol/L的NSC348884處理細胞，培養24 h后收集細胞，冷磷酸鹽緩沖液洗滌，重懸于4℃、70%酒精中固定過夜，離心后加入200 μg/ml RNA酶400 μl 37℃處理30 min，再加入 15 μg/ml碘化丙啶 100 μl 4℃避光處理30 min，流式細胞儀 (美國Beckman公司)檢測細胞凋亡率。

統計學處理所有實驗均重復3次，使用SPSS 13.0統計軟件包處理數據，采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，數據以均數±標準差表示，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

NSC348884抑制HepG2細胞增殖活性MTT結果顯示，NSC348884在0.01 μmol/L低濃度時吸光度與對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05);濃度為0.1 μmol/L 和 1 μmol/L 時，細胞存活率分別為(72.333±5.774)%和 (74.667±4.163)%、二者比較差異無統計學意義 (P＞0.05);當濃度在1～10 μmol/L之間時，明顯抑制了細胞的生長，濃度為2、5、10 μmol/L時存活率分別為(35.333±4.041)%、(17.667±2.082)%、(22.333±2.887)%，與對照組比較差異有統計學意義 (P＜0.05);NSC348884濃度為 40、50 μmol/L時，存活率分別為 (26.333±1.528)%、(28.000±1.732)%、二者比較差異無統計學意義 (P＞0.05)。NSC348884對肝癌細胞HepG2的半數抑制濃度 (50%inhibiting concentration，IC50)為 1.4 μmol/L。

NSC348884破壞HepG2細胞NPM寡聚物結構0 μmol/L 及2 μmol/L NSC348884 處理 HepG2 細胞24 h后，與0 μmol/L組相比，2 μmol/L組的NPM寡聚物表達量明顯降低，而單體的表達量增高 (圖1)。圖像分析結果顯示，2 μmol/L組寡聚物蛋白條帶灰度比值 (0.289±0.035)明顯低于0 μmol/L組寡聚物蛋白條帶灰度比值 (1.443±0.041)(P＜0.05);而2 μmol/L組單體蛋白條帶灰度比值(1.781±0.101)明顯高于0 μmol/L組單體蛋白條帶灰度比值 (1.122±0.007)(P＜0.05)。

圖1 NSC348884特異性破壞NPM寡聚物結構Fig 1 NSC348884 specifically disrupts NPM oligomer

NSC348884誘導HepG2細胞的凋亡0、1、2 μmol/L NSC348884處理HepG2細胞24 h后，凋亡率分別為 (6.950±0.207)%、(13.770±0.335)%、(19.021±0.237)%。處理組與對照組比較，差異有統計學意義 (P ＜0.05);2 μmol/L與1 μmol/L處理組比較，差異有統計學意義 (P＜0.05)(圖2)。

討 論

HCC一經發現多為晚期，對不宜手術者，化療是主要的治療方法。化療藥物的作用機制很多，而蛋白-蛋白相互作用位點是強有力的干預靶點，是發展抗癌藥物的熱點，目前以蛋白-蛋白相互作用位點為靶點的化療藥物的應用已經成為現實［5］。

NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，其結構特征包括一個氨基末端保守的寡聚化區［6-7］，NPM的寡聚化可能是調節NPM多種功能的必要步驟［8］。研究表明，NPM在多種實體腫瘤中存在高表達，被認為是結腸癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌的腫瘤標志物之一［9］。此外，有研究表明Rev蛋白的一個肽與NPM結合使Ras轉化的NIH-3T3細胞產生細胞毒性，從而抑制裸鼠模型中腫瘤的生長［10］。這是關于抑制NPM后產生抗腫瘤作用的首次報道。

圖2 NSC348884誘導肝癌細胞HepG2凋亡Fig 2 NSC348884 induces the apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

基于上述研究，Qi等［3］通過對NPM分子模型三維結構的研究，確定影響其寡聚物形成的藥效基團，然后經計算機篩選以及相互作用而確定了一種NPM的小分子抑制劑——NSC348884。他們的研究表明NSC348884以1.7～4.0 μmol/L的IC50在多種癌細胞系中抑制了細胞的增殖。Yun等［4］的最新研究證實，NPM在HCC中呈高表達，且顯著高于非癌肝組織;NPM在HCC中的高表達與增殖細胞核抗原水平以及血清甲胎蛋白、肝硬化等臨床預后參數相關;NPM可能是潛在的HCC標志物。因此，NPM可能是一個潛在的原癌基因，將可能成為肝癌治療的新靶點。

本研究應用MTT比色法測定NSC348884對HepG2細胞存活率的影響，結果顯示NSC348884對肝癌細胞HepG2生長有抑制作用，藥物濃度在1～10 μmol/L之間時，對細胞的抑制作用最明顯，隨藥物濃度增加，細胞的存活率降低，呈劑量-效應關系。NSC348884的IC50為1.4 μmol/L。隨后通過對不同濃度NSC348884處理組進行Native PAGE、SDSPAGE免疫印跡檢測，結果表明NSC348884能特異性破壞肝癌細胞HepG2中NPM寡聚物結構，促使其寡聚物轉化為單體，這是NSC348884發揮抗腫瘤作用的分子基礎。

研究表明，NSC348884通過上調p53(增加15位絲氨酸的磷酸化)，以劑量依賴方式誘導多種腫瘤細胞的凋亡［3］。本研究用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示NSC348884以劑量依賴方式誘導了肝癌細胞HepG2凋亡的發生，而有關誘導肝癌細胞凋亡的具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，本研究顯示NSC348884通過促使肝癌細胞HepG2中NPM寡聚物轉化為單體，從而抑制HepG2細胞的體外增殖，并且可以誘導肝癌細胞凋亡，而其誘導肝癌細胞凋亡的機制尚需進一步研究。

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