高糖膳食對載脂蛋白AI基因-75 G/A多態性不同基因型健康青年血脂及載脂蛋白比值的影響

宋永燕，歐國進，龔仁蓉，張 珍，胡敏珊，樊 梅，李元昊，方定志

1四川大學華西基礎醫學與法院學院生物化學與分子生物學教研室，成都 6100412川北醫學院基礎醫學院生物化學教研室，四川南充 6370003四川大學華西醫院胸心外科，成都 610041

·論著·

高糖膳食對載脂蛋白AI基因-75G/A多態性不同基因型健康青年血脂及載脂蛋白比值的影響

宋永燕1,2，歐國進1，龔仁蓉3，張 珍1，胡敏珊1，樊 梅1，李元昊1，方定志1

1四川大學華西基礎醫學與法院學院生物化學與分子生物學教研室，成都 610041
2川北醫學院基礎醫學院生物化學教研室，四川南充 637000
3四川大學華西醫院胸心外科，成都 610041

目的探討高糖膳食對載脂蛋白AI基因(APOA1)啟動子區-75 G/A多態性不同基因型健康青年血脂及載脂蛋白比值的影響。方法給予56名平均年齡為(22.89±1.80)歲的健康青年7 d平衡膳食和6 d高糖膳食。平衡膳食的熱量組成為15%蛋白質、31%脂肪和54%碳水化合物；高糖膳食的熱量組成為15%蛋白質、15%脂肪和70%碳水化合物。于膳食干預的第1天、第8天和第14天清晨抽取12 h空腹靜脈血，測定血脂及載脂蛋白濃度，計算甘油三酯(TG)/高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TC)/HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)/HDL-C及載脂蛋白B100(APOB100)/載脂蛋白AI(APOAI)的比值。提取全基因組DNA，聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法分析APOA1-75 G/A多態性。結果基礎值時，血脂及載脂蛋白比值在男性基因型之間的差異無統計學意義(Pgt;0.05)；在女性中，A等位基因攜帶者LDL-C/HDL-C顯著高于GG基因型受試者(Plt;0.05)。高糖膳食后，TC/HDL-C在各性別和基因型分組中均顯著降低(Plt;0.01)。LDL-C/HDL-C在男性各基因型中顯著降低(Plt;0.05)；在女性中，LDL-C/HDL-C僅在A等位基因攜帶者中顯著降低(Plt;0.01)，在GG基因型受試者中差異無統計學意義(Pgt;0.05)。結論APOA1 -75 G/A多態性A等位基因可能對其女性攜帶者的LDL-C/HDL-C比值有一定的影響。

載脂蛋白AI；基因多態性；高糖膳食；血脂及載脂蛋白比值

ActaAcadMedSin, 2012, 34(1):1-7

脂代謝紊亂是導致心血管疾病的主要危險因素之一[1]。臨床上一般以低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)作為評估心血管疾病危險性及預后的主要指標，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和/或高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)作為輔助評價指標。然而，近年來報道與HDL-C相關的血脂比值包括TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C和TG/HDL-C與心血管疾病的相關性更為密切，是評價心血管疾病的綜合性指標，在預測發病風險度方面優于單純的血脂水平[2-3]。載脂蛋白B100(apolipoprotein B100，APOB100)/載脂蛋白AI(apolipoprotein AI, APOAI)是另一個最近被廣泛報道的比值指數，在預測動脈粥樣硬化及冠心病發生的敏感度上可能較其他血脂比值更高[1,4]。

遺傳背景和膳食結構是影響血脂的重要因素。然而，目前國內外對與脂代謝密切相關的載脂蛋白基因變異對健康青年血脂比值的影響還少有報道，這些變異與高糖膳食的相互作用及其對血脂及載脂蛋白比值的影響更鮮見報道。本研究分析了高糖膳食與APOA1-75 G/A位點多態性共同對健康青年人血脂及載脂蛋白比值的影響，為不同遺傳背景的個體合理選擇膳食提供科學依據。

對象和方法

受試對象招募四川大學在校健康大學生60名，男女各30名，均為漢族，年齡20～30歲，平均(22.89±1.80)歲。受試前對所有志愿者進行體檢和健康調查，確證無心腦血管疾病史及慢性消耗性疾病史，未服用激素類藥物以及其他影響糖、脂代謝的藥物。受試前均簽署知情同意書。參加本研究的60名志愿者中，4名因個人原因未能完成膳食干預，其余56名按要求完成了整個試驗過程，其中男27名，女29名。

高糖膳食受試者在進行高糖膳食前統一食用7 d平衡膳食，以消除招募前各受試對象的膳食差異而導致的誤差。平衡膳食的熱量組成為15%蛋白質、31%脂肪和54%碳水化合物。平衡膳食結束的第2天立即進行高糖膳食，其熱量組成為15%蛋白質、15%脂肪和70%碳水化合物，干預期為6 d。平衡膳食和高糖膳食均由四川大學華西醫院營養科配制(表1)。膳食以早餐(07:30～08:30)、午餐(11:30～12:30)和晚餐(17:30～18:30)每天3次提供，對受試者的膳食攝入量不作限制，以自覺飽感為準。在膳食干預期間，所有的受試對象除食用統一配制的膳食及自由飲水外，不得攝入其他食物如零食、水果或飲料。日常生活習慣無限制。

血脂及載脂蛋白測定開始平衡膳食的第1天、第8天和第14天清晨抽取12 h空腹靜脈血5 ml。分離血清并立即進行血脂及載脂蛋白測定。酶比色法測定血清TG和TC濃度。磷鎢酸-鎂沉淀法分離高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)并采用酶法測定HDL-C的含量。聚乙烯硫酸鹽沉淀非低密度脂蛋白并用酶法測定非LDL-C的含量，然后用TC減去非LDL-C算出LDL-C的濃度。免疫沉淀法測定APOAI和APOB100。所有指標重復測定3次，平均值用于各血脂及載脂蛋白比值的計算。

APOA1-75G/A多態性分析

DNA提?。夯蚪MDNA分離自外周血白細胞，采用Tiandz公司的血液DNAout試劑盒進行DNA提取，操作過程按試劑盒說明書進行。

PCR擴增含有APOA1-75 G/A位點的DNA片段：PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列Forward： 5’-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3’；Reverse：5’-TTAGGGGACACCTAGCCCTCAGGAAGAGCA-3’。PCR反應體系(25 μl)：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×PCR TaqMix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR擴增程序：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環35次后72℃延伸5 min。

限制性內切核酸酶分析：MspI酶切反應體系(10 μl)：PCR產物1 μl，MspI內切酶(NEB)10 U，10×NEB緩沖液1 μl，ddH2O補至10 μl。37℃水浴16 h后，3%瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠-紫外顯色鑒定基因型。

統計學處理所有數據采用均數±標準差表示。高糖膳食前后各指標的比較采用配對t檢驗，不同基因型之間各指標的比較采用獨立樣本t檢驗，Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

結 果

APOA1-75G/A多態性基因型及等位基因頻率分布-75 G/A位點位于APOA1基因的啟動子區域，對該區的擴增片段總長度為434 bp。多態性位點由鳥嘌呤(G)變異成腺嘌呤(A)生成，變異后限制酶MspI的識別序列(5’-C↓CGG-3’)消失，從而失去切割位點。被擴增的DNA片段含3個MspI酶切位點，包括1個固有切點和2個多態性位點。酶切后，GG基因型圖譜上含有67 bp和113 bp的2個片段；GA基因型含有67 bp、113 bp和180 bp的3個片段；AA基因型僅含180 bp的片段(圖1)。56名受試者中，GG基因型28名，占50%；GA基因型23名，占41.1%；AA基因型5名，占8.9%。主要等位基因G頻率為70.5%，次要等位基因A頻率為29.5%?；蛐秃偷任换蝾l率分布均無性別差異?；蝾l率分布符合Hardy-Weinberg定律(χ2=0.017，P=0.895)。

表 1 平衡膳食和高糖膳食的組成成分

M：標準分子量DNA；1, 2, 4, 6泳道為GG基因型；3, 5, 7泳道為GA基因型M: DNA marker; 1, 2, 4, 6: GG genotype; 3, 5, 7: GA genotype

APOA1-75G/A位點不同基因型受試者血脂及載脂蛋白比值的基礎值本研究群體中AA基因型僅有5名，故將GA基因型和AA基因型合并為A等位基因攜帶者進行統計學分析。在整體受試人群中，所有基礎值指標在不同基因型之間差異均無統計學意義。按性別分組后，發現女性受試者中A等位基因攜帶者LDL-C/HDL-C較GG基因型受試者顯著升高(Plt;0.05)(表2)。

APOA1-75G/A位點不同基因型受試者高糖膳食前后血脂及載脂蛋白比值的變化高糖膳食前和高糖膳食后，無論在整體受試人群還是在男女分組中，血脂及載脂蛋白比值在不同基因型之間差異均無統計學意義(Pgt;0.05)。在整體受試人群中，與高糖膳食前相比，高糖膳食后TC/HDL-C(Plt;0.01)和LDL-C/HDL-C(Plt;0.01)在GG基因型受試者和A等位基因攜帶者中均顯著降低；TG/HDL-C和APOB100/APOAI的變化在GG基因型受試者和A等位基因攜帶者中差異均無統計學意義(Pgt;0.05)。按性別分組后，男性受試者高糖膳食后TC/HDL-C(Plt;0.01)和LDL-C/HDL-C(Plt;0.05)在GG基因型受試者和A等位基因攜帶者中均顯著低于高糖膳食前，TG/HDL-C和APOB100/APOAI的變化在GG基因型受試者和A等位基因攜帶者中差異均無統計學意義(Pgt;0.05)；女性受試者高糖膳食后TC/HDL-C(Plt;0.01)在GG基因型受試者和A等位基因攜帶者中均顯著低于高糖膳食前，LDL-C/HDL-C僅在A等位基因攜帶者中顯著降低(Plt;0.01)，而TG/HDL-C和APOB100/APOAI在GG基因型受試者和A等位基因攜帶者中的差異均無統計學意義(Pgt;0.05)(表3)。

表 2 APOA1-75 G/A位點不同基因型受試者血脂及載脂蛋白比值的基礎值

表 3 APOA1-75 G/A位點不同基因型受試者高糖膳食前后的血脂及載脂蛋白比值

討 論

APOAI是HDL的主要載脂蛋白，在膽固醇的逆向轉運中發揮重要作用。在體內HDL不僅參與膽固醇的逆向轉運，而且具有抗氧化、抗栓塞、抗炎性等生理特性[5-6]，這些特性與其抗動脈粥樣硬化的保護機制有關。血漿HDL和APOAI水平降低伴隨心血管病發病風險增加[7-8]。APOAI可激活卵磷脂-膽固醇酯酰轉移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT)，此酶在血漿中催化游離膽固醇酯化，促進HDL顆粒的形成和成熟。在APOA1基因內部及周圍已發現多個遺傳變異位點，其中位于啟動子區域的-75 G/A位點研究較多。研究發現A等位基因與APOA1轉錄活性增強以及APOAI和HDL的血漿濃度升高關系密切[9-12]，提示A等位基因可能是心血管疾病的保護性遺傳因素。但在西班牙的一項病例對照研究[13]中，研究人員發現A等位基因頻率在男性心肌梗塞患者中顯著高于健康對照組，這說明A等位基因對心血管疾病的遺傳效應可能與種族、性別及年齡相關。

本研究中，基礎比值TG/HDL-C、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C和APOB100/APOAI在男性不同基因型之間的差異無統計學意義，但女性A等位基因攜帶者LDL-C/HDL-C顯著高于GG基因型受試者，提示在我國青年女性中A等位基因是升高LDL-C/HDL-C比值的遺傳因素。高糖膳食后，TC/HDL-C在所有受試者中均顯著降低，可能是因為在我國青年群體中，高糖膳食對TC/HDL-C的降低幅度較大，掩蓋了不同遺傳背景及性別的影響。我國是一個以淀粉類食物為主的國家，與歐美國家相比我國人群的血脂組成較為理想，心血管病的發病率也相對較低[14-15]。中國人群在長期的進化中可能已對淀粉類食物產生了適應性，表現為高糖膳食干預后TC/HDL-C大幅降低。

在本研究組前期的研究中，發現整體受試人群高糖膳食后TC和LDL-C顯著降低、TG和HDL-C顯著升高[16]，以及TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C比值顯著降低[17]。本研究按性別和APOA1-75 G/A多態性分組分析后發現，TC/HDL-C在各亞組中均顯著降低，而LDL-C/HDL-C僅在男性組各基因型及女性A等位基因攜帶者中顯著降低，在女性GG基因型受試者中的差異無統計學意義。基礎值時，女性A等位基因攜帶者LDL-C/HDL-C顯著高于女性GG基因型受試者，高糖膳食后LDL-C/HDL-C在女性A等位基因攜帶者中顯著降低，在女性GG基因型中沒有明顯變化。結果提示，APOA1-75 G/A多態性A等位基因可能對其女性攜帶者的LDL-C/HDL-C比值有一定的影響。

在本研究中，基礎值時女性A攜帶者的LDL-C/HDL-C比值顯著高于GG基因型受試者；高糖膳食后LDL-C/HDL-C比值的變化在女性A攜帶者中有統計學意義，而在女性GG基因型受試者中差異無統計學意義。陽性結果都出現在女性中，這可能與女性具有較高的雌性激素水平密切相關。雌性激素顯著影響脂蛋白酯酶的活性[18]。體外實驗中，Rinninger等[19]研究發現脂蛋白酯酶促進肝細胞對HDL中膽固醇酯的選擇性吸收，具有降低循環中HDL-C的作用。女性雌性激素水平較高，對脂蛋白酯酶的活性影響較強，也較強地影響著肝細胞對HDL中膽固醇酯的攝取和降解。APOAI是HDL的重要組成部分，也是血漿脂蛋白、尤其是HDL代謝的重要調節因素。在具有較高雌性激素水平的女性中，APOA1-75 G/A多態性更容易對高糖膳食誘導的LDL-C/HDL-C比值變化產生影響。至于還有無其他因素使本研究陽性結果僅出現在女性，有待進一步研究。

綜上所述，高糖膳食對我國健康青年APOA1-75 G/A多態性不同基因型受試者的血脂比值有調節作用，且這種調節作用主要體現在女性受試者中。該結果還需在多個種族、更多人群及大樣本的研究中進一步證實，以為具有不同遺傳背景的個體合理選擇膳食提供依據。

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EffectsofaHigh-carbohydrateDietontheSerumLipidandApolipoproteinRatiosinHealthyYoungAdultswithDifferentGenotypesofAPOA1-75G/APolymorphism

SONG Yong-yan1,2, OU Guo-jin1, GONG Ren-rong3, ZHANG Zhen1,HU Min-shan1, FAN Mei1, LI Yuan-hao1, FANG Ding-zhi1

1Department of Biochemistry and Molecular Biology Laboratory, West China School of
Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China
2Department of Biochemistry, School of Preclinical Medicine, North Sichuan Medical College,
Nanchong, Sichuan 637007, China
3Department of Cardiac and Thoracic Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

FANG Ding-zhi Tel: 028-85471567, E-mail: dzfang@scu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effects of a high-carbohydrate diet on the lipid and apolipoprotein ratios in healthy young adults with different genotypes of the polymorphism at -75 site in the promoter region of the gene of apolipoprotein AI (APOA1).MethodsFifty-six subjects aged (22.89±1.80) years were given a wash-out diet for 7 days, followed by a high-carbohydrate diet for 6 days. The wash-out diet contained 15% protein, 31% fat, and 54% carbohydrate. The high-carbohydrate diet contained 15% protein, 15% fat, and 70% carbohydrate. Twelve-hour fasting serum lipids and apolipoproteins B100 and AI were measured on the mornings of the 1st, the 8th, and the 14th days from the beginning of the wash-out diet. The ratios of triglyceride (TG)/high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), total cholesterol (TC)/HDL-C, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C)/HDL-C, and apolipoprotein B100 (APOB100)/apolipoprotein AI (APOAI) were calculated. The genome DNA was extracted and the polymorphism of APOA1-75 G/A was determined by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism assay.ResultsAt baseline, the lipid and apolipoprotein ratios showed no significant differences between the GG genotype and the A carriers in males (Pgt;0.05), whereas the female A carriers had a significantly higher ratio of LDL-C/HDL-C compared with the female subjects with the GG genotype (Plt;0.05). Following the high-carbohydrate diet, significant decreases of TC/HDL-C were found in all the groups, regardless of sex and genotype (Plt;0.01). LDL-C/HDL-C experienced significant decreases in both the genotypes in males (Plt;0.05), while in females, significant decrease of LDL-C/HDL-C was only observed in A carriers (Plt;0.01).ConclusionThe A allele of the -75 G/A polymorphism in APOA1 may have specific effects on the LDL-C/HDL-C ratio in females.

apolipoprotein AI; gene polymorphism; high-carbohydrate diet; lipid and apolipoprotein ratios

方定志 電話：028-85471567，電子郵件：dzfang@scu.edu.cn

R713.8

A

1000-503X(2012)01-0001-07

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.01.001

教育部新世紀優秀人才支持計劃(NCET-04-0863)Supported by the Program for New Century Excellent Talents in Universities in China (NCET-04-0863)

2011-05-10)