塔克拉瑪干 “沙漠人”熱習服生理特性與血管緊張素轉換酶基因插入/缺失和醛固酮合成酶基因啟動子區C-344T多態性的相關性

曹海濤，邱長春，程祖亨，丁志堅

1南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院心內科，江蘇常州213000

2中國醫學科學院 北京協和醫學院 基礎醫學研究所分子生物學實驗室，北京100005

3新疆醫科大學第一附屬醫院心臟中心，烏魯木齊830000

新疆的塔克拉瑪干大沙漠以“死亡之海”聞名于世，是中國第一、世界第二的大沙漠，全年降水量約14 mm，蒸發量約3000 mm，極度干旱。夏季炎熱，氣溫可高達50～60℃。在這死亡之海的腹地，沿克里雅河下游兩岸生活著一個幾乎與世隔絕的游牧部落“克里雅人”。因其居住在大沙漠腹地，1958年才被中國科學院治沙隊和石油重力隊發現，故被稱為“沙漠人”，總人口約有千余人。克里雅人群的起源問題至今未有定論，從這里居民的宗教信仰、飲食文化和人種特征看，和維吾爾族非常相似［1］。

對于新疆“沙漠人”的前期流行病學調查表明，在當地常年夏季氣溫高于40℃，濕度＜40%的干熱環境下，這一特殊的封閉人群仍然能維持正常的生理功能，其機體的中心體溫、體質指標、電解質與酸堿環境均能維持動態平衡狀態，這無疑把研究熱點引向了熱適應生理調節過程中各個重要環節的基因調控機制上。血管緊張素轉換酶 (angiotensin-converting enzyme，ACE)和醛固酮合成酶與機體水鹽代謝密切相關，水鹽代謝又是機體熱習服中的重要環節，因此筆者認為調控這兩個酶的基因多態性可能與“沙漠人”熱習服有關。本研究旨在探討塔克拉瑪干“沙漠人”熱習服生理特性與ACE基因插入/缺失 (insertion/deletion，I/D)和醛固酮合成酶基因(CYP11B2)啟動子區C-344T多態性的關系。

對象和方法

研究對象調查時間為2005年9月7日至16日及2008年10月6日至12日，研究對象為隨機抽取的新疆塔克拉瑪干“沙漠人”居住地新疆和田地區于田縣達里雅布依鄉年齡≥16歲的“沙漠人”503名(約占“沙漠人”成年人的60.97%)，以及按年齡、性別和地區匹配原則隨機抽取的新疆和田地區于田縣先拜巴扎鎮≥16歲的維吾爾族成年人237名 (對照組)。研究經新疆醫科大學醫學倫理委員會及和田地區地委的批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

問卷調查收集被研究人群的人口學資料及家族史、現病史 (高血壓、糖尿病和腫瘤等)、個人史(吸煙、飲酒等)、飲食習慣及24 h膳食回顧調查及膳食頻率問卷調查等資料。

體格檢查及樣本收集測量身高、體重、腰圍、血壓、心率，檢查靜態心電圖、視力和眼底等。每人抽取清晨空腹靜脈血5 ml于10 ml(含1 ml 2%EDTA-Na2)抗凝管中，現場分離血漿，取上層血漿低溫保存，以測定電解質及其他生化指標，下層血細胞 (包括紅細胞和白細胞)冰凍在-20℃冰箱內，用于基因組DNA的提取和基因分析。同時取晨尿100 ml于干凈玻璃瓶中封口待測，低溫保存。

實驗室檢查采用全自動生化分析儀 (在新疆醫科大學第一附屬醫院檢驗中心完成)測定電解質、血糖、血脂、肝腎功能、血清鐵;檢測血清免疫球蛋白、補體C3、補體C4、抗鏈球菌溶血素O、類風濕因子、超敏 C-反應蛋白 (high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)等，以評估機體的免疫功能。尿樣檢查項目:尿十項、尿鉀、尿鈉、尿鈣、尿鎂、尿肌酐、24 h尿總蛋白、尿微量白蛋白等。

基因組DNA提取采用經典的酚—氯仿抽提法［2］，根據紅、白細胞滲透脆性不同的特點，用低滲法去除紅細胞，然后在蛋白酶K及十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)的作用下37℃消化過夜，等體積酚—氯仿抽提去除蛋白，最后乙醇沉淀析出基因組 DNA，溶于 TE緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中，4℃保存。紫外分光光度法測定基因組DNA樣品的純度，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。

基因型鑒定采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和瓊脂糖凝膠電泳的方法鑒定 ACE基因、CYP11B2基因C-344T的基因型 (在中國醫學科學院基礎醫學研究所完成)。PCR擴增反應采用PTC-100 PCR擴增儀 (型號:MA02172，美國 BIO-RAD公司)，反應體系為25 μl。PCR擴增反應引物、擴增片段長度、酶以及酶切片段見表1。PCR擴增條件:ACE基因:94℃ 5 min，94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 40 s，35個循環，72℃ 5 min;C-344T:94℃ 5 min，94℃ 60 s，62℃60 s，72℃ 90 s，35個循環，72℃ 10 min。

PCR產物序列分析分別從“沙漠人”組隨機選取50個樣本和對照組中隨機選取20個樣本進行直接測序 (由北京奧科生物科技發展有限公司完成)，結果表明酶切方法鑒定的基因型與測序鑒定的基因型的符合率達100%。

質量控制調查主要由心血管內科專職工作人員操作，均嚴格經過營養膳食調查培訓，并配有精通維吾爾語的專業醫務工作者進行語言翻譯。血生化分析測定及基因檢測采用盲法，均由專業人員完成。膳食調查采用24 h膳食回顧調查及膳食頻率問卷調查法，運用中國疾病預防控制中心營養計算器V1.6軟件進行每人每日營養素攝入量及能量比計算。

統計學處理應用SPSS 15.0統計分析軟件進行統計學處理。連續變量用均數±標準差表示。所用資料在進行兩組分析比較時，資料符合正態分布且方差齊時，均數間比較采用t檢驗;資料符合正態分布但方差不齊時，均數間比較采用t'檢驗。計數資料用構成比、率描述其基本特征，各組間頻率比較采用2×2、R×C列聯表χ2檢驗。等位基因和基因型頻率的估計采用基因記數方法。Hardy-Weinberg平衡用χ2檢驗。采用χ2檢驗法估計每個多態性位點與“沙漠人”熱習服生理特性之間的關聯性以及是否具有統計學意義。所有的統計學檢驗以雙側概率P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

“沙漠人”與對照組一般體征及血脂、血糖水平的比較“沙漠人”組男293名，女210名，平均年齡 (35.72±16.40)歲;對照組男138名，女99名，平均年齡 (37.30±18.31)歲。兩組間年齡和性別構成比差異無統計學意義 (P＞0.05)。“沙漠人”組腰圍和體重指數明顯小于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.01)。“沙漠人”組平均舒張壓、收縮壓和空腹血糖水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.001);血脂除高密度脂蛋白膽固醇明顯高于對照組外 (P＜0.001)，甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均明顯低于對照組(P＜0.01)(表2)。若按兩組間發病率計算比較，“沙漠人”高血壓、高血脂、糖尿病發病率均明顯低于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.05)。

表1 PCR擴增反應的引物序列及酶切反應條件

表2 “沙漠人”組與對照組的一般體征、血壓、血脂、血糖水平的比較 (±s)

表2 “沙漠人”組與對照組的一般體征、血壓、血脂、血糖水平的比較 (±s)

BMI:體重指數;TG:甘油三酯;TC:總膽固醇;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇:HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;1 mm Hg=0.133 kPa

BMI(kg/m2)腰圍(cm)收縮壓 (mm Hg)舒張壓 (mm Hg)組別例數 數值對照組 237 22.66±4.18 237 77.25±10.16 237 122.57±21.43 237 80.35±15.40“沙漠人”組 503 21.25±3.10 503 73.43± 9.10 503 109.81±18.36 503 72.58±11.39 t值例數 數值 例數 數值 例數 數值-3.21 -3.73 -5.58 -4.81 P值 0.002 0.000 0.000 0.000 TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)空腹血糖 (mmol/L)組別例數 數值對照組 235 1.50±1.29 235 3.26±0.85 235 0.53±0.23 235 1.66±0.60 235 5.56±1.39“沙漠人”組 500 0.98±0.77 500 2.23±1.02 500 0.72±0.33 500 1.41±0.68 500 4.43±1.19 t值例數 數值 例數 數值 例數 數值 例數 數值0.000 0.000 0.000 0.001 0.000-3.98 -10.69 6.60 -3.42 -6.78 P值

“沙漠人”與對照組血液中免疫球蛋白水平的比較“沙漠人”組血清IgG、IgA和對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05);IgM水平明顯低于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.001);hs-CRP水平明顯高于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.05)(表3)。

“沙漠人”與對照組主要血清電解質及其攝入量的比較“沙漠人”血清鈉水平高于對照組，血清鉀水平低于對照組，差異均有統計學意義 (P＜0.001)。 “沙漠人”血清電解質有高鈉低鉀特點。而“沙漠人”膳食中鹽、鈉、鉀攝入量均低于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.001)(表4)。

Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗ACE基因和CYP11B2基因C-344T位點的各基因型頻率在“沙漠人”組和對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 (ACE基因: “沙漠人”組P=0.928，對照組P=0.712;C-344T位點:“沙漠人”組P=0.06，對照組P=0.271)，說明所選擇的樣本具有群體代表性。

ACE基因的單位點分析ACE基因I/D多態性的基因型和等位基因頻率在“沙漠人”組和對照組間的分布見表5。ACE基因的基因型和等位基因頻率在兩組間的差異均無統計學意義 (P＞0.05)。

CYP11B2基因C-344T的單位點分析CYP11B2基因C-344T位點的基因型和等位基因頻率在“沙漠人”組和對照組間的分布見表5。該位點基因型和等位基因頻率的分布在兩組間的差異均具有統計學意義 (P＜0.05)。該位點攜帶T等位基因的基因型在“沙漠人”組高于對照組 (OR=1.48;95%CI:1.082～2.023)，可能為有利于“沙漠人”熱習服的因素。

CYP11B2基因的單倍型分析CYP11B2基因C-344T和K173R兩個多態性位點構成的4個單倍型在“沙漠人”組和對照組間總體上差異無統計學意義 (χ2=6.88，P=0.076)。但在所有單倍型中，包含CYP11B2基因-344T和173K等位基因的H1單倍型在“沙漠人”組明顯高于對照組，差異有統計學意義 (χ2=4.898，P=0.027)(表 6)。

表3 “沙漠人”組與對照組人群血清免疫球蛋白水平的比較 (±s)

表3 “沙漠人”組與對照組人群血清免疫球蛋白水平的比較 (±s)

組別 超敏C反應蛋白 (mg/L)IgG(g/L)IgA(g/L)IgM(g/L)對照組 (n=235)“沙漠人”組 (n=500)0.49±1.22 1.85±6.15 9.62±2.71 9.67±4.36 1.59±0.92 1.48±0.93 1.54±0.62 1.23±0.58 t值 P值2.410 0.018 0.151 0.880-1.052 0.293-4.781 0.000

表4 “沙漠人”與對照組主要血清電解質及其膳食攝入量的比較 (±s)

表4 “沙漠人”與對照組主要血清電解質及其膳食攝入量的比較 (±s)

組別 血清鉀 (g)血清鈉(g)攝鹽量 (g)鈉攝入量(g)鉀攝入量(g)對照組 (n=235)4.60±0.53 138.30±4.06 10.85±2.44 4.60±1.18 3.26±0.77“沙漠人”組 (n=500)4.29±0.57 143.26±4.66 5.02±1.43 2.26±0.66 2.05±0.61 t值-4.34 5.38 -22.43 -18.66 -14.22 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 ACE基因和CYP11B2基因C-344T位點的基因型及等位基因頻率在“沙漠人”組和對照組的分布

表6 “沙漠人”組與對照組CYP11B2基因C-344T和K173R兩個多態性位點單倍型的比較

討 論

熱習服是機體在長期反復熱作用下出現的一系列適應性反應，表現為機體對熱的反射調節機能更趨完善，各種生理機能達到一個新的水平，如代謝率降低，出汗散熱作用增強，體溫脈搏呼吸反應穩定，汗中氯化鈉含量降低，肌肉活動能力明顯提高，主觀感覺好轉，中暑發生率降低。熱習服的生理表現主要體現在體溫調節、出汗機能、水鹽代謝、心血管系統功能的適應性變化等方面［2］。

塔克拉瑪干沙漠幾乎終年不下雨，加上太陽的烘烤和超量的蒸發，使得這里極度干旱，成為世界少有的干極、熱極之一。“沙漠人”對干熱環境的耐受超乎人們所想象，他們在酷熱難耐、白天氣溫高達50℃的環境下，很少出汗，也無口渴表現，表現出對干旱、酷熱極端環境的超強適應能力。這一人群必然有其特殊的體質指標和電解質酸堿平衡狀態，也肯定會有特殊的遺傳基礎。由于“沙漠人”所處的特殊地理位置以及交通的險阻，使得他們很少與外界聯系，更重要的是他們也幾乎不與外界通婚，因此其基因多態性還未受到外部人群的干擾，這在當今世界上也是極其罕見的，是進行基因研究的寶貴群體［3-4］。

本研究結果顯示“沙漠人”組腰圍和體重指數均顯著小于對照組人群，這可能與“沙漠人”為適應這種極端干熱環境有關。免疫球蛋白是一組具有抗體活性的蛋白質，是檢查機體體液免疫功能的重要指標。“沙漠人”組血清IgM平均水平顯著低于對照組人群，這可能與沙漠中氣候干熱，與外界隔絕，沒有蚊蠅，不利于細菌和病毒生存，因而各種流行病和傳染病較少有關。此外，“沙漠人”組血清hs-CRP水平顯著高于對照組，可能與沙漠嚴酷環境的應激反應增加有關。

“沙漠人”組膳食中鹽、鈉、鉀攝入量均顯著低于對照組，而其血清鈉水平顯著高于對照組，血清鉀水平顯著低于對照組，說明“沙漠人”血清電解質有高鈉低鉀特點。眾所周知，醛固酮具有保鈉排鉀作用，推測“沙漠人”血清電解質高鈉低鉀特點可能與“沙漠人”為適應沙漠干熱環境，腎素-血管緊張素-醛固酮系統發生適應性改變，機體合成分泌醛固酮增多，發揮保水保鈉作用來維持體液和電解質平衡有關。

血管緊張素作用于腎血管，使腎血管收縮，腎血流量減少，從而發揮保水、保鈉作用，血容量增加，有利于機體熱習服。但本研究結果顯示:ACE基因的I/D多態性的各基因型和等位基因頻率的分布在“沙漠人”組和對照組間的差異均無統計學意義，提示單基因單位點分析“沙漠人”ACE基因的I/D多態性與“沙漠人”熱習服生理特性無關聯。但這并不能排除該基因其他區域的變異或與鄰近基因的交互作用在“沙漠人”熱習服生理特性中的作用。

醛固酮是人體內最重要、作用最強的鹽皮質激素，在機體水鹽代謝及維持電解質平衡中發揮重要作用。醛固酮合成酶是醛固酮生物合成過程中催化最后一步生化反應的關鍵酶，醛固酮合成酶基因CYP11B2調控醛固酮合成酶的生成而與機體熱習服相關聯，目前有關CYP11B2基因多態性位點的研究主要包括啟動子區的C-344T和第三外顯子的K173R，其中研究較多的是C-344T位點多態性。本研究結果顯示:CYP11B2基因C-344T位點的各基因型和等位基因頻率的分布在“沙漠人”組和對照組間的差異均具有統計學意義，該位點攜帶T等位基因的基因型在“沙漠人”組高于對照組 (OR=1.48;95%CI:1.082～2.023)。單倍型分析也支持上述結論，CYP11B2基因C-344T和K173R兩個多態性位點構成的4個單倍型在“沙漠人”組和對照組間總體上差異無統計學意義 (P＞0.05)。但在所有單倍型中，包含CYP11B2基因-344T和173K等位基因的單倍型在“沙漠人”組高于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.05)。因此推測，該位點攜帶T等位基因的基因型可能為有利于“沙漠人”熱習服的因素。

結合“沙漠人”的特殊生理特征分析， “沙漠人”為適應干熱生存環境，維持體液和電解質平衡，機體合成分泌醛固酮增多，因此調控醛固酮合成分泌的醛固酮合成酶基因發生突變，突變為攜帶T等位基因的基因型個體。已有研究證明在干熱環境下，醛固酮合成酶基因表達水平和酶活性的改變可直接影響醛固酮的分泌，進而影響水鹽代謝的平衡。在CYP11B2基因-344T/C多態性的研究中，發現不同基因型人群的醛固酮濃度不同。Hautanen等［5］對正常男性進行尿醛固酮定量檢測發現:-344TT基因型較-344CC基因型有較高的尿醛固酮含量;Davies等［6］發現T等位基因正常人群的24 h尿醛固酮定量明顯高于C等位基因人群;Paillard等［7］在正常人群CYP11B2基因-344T/C多態性與血漿醛固酮濃度的研究中，發現T等位基因與高醛固酮濃度密切相關。因此推測“沙漠人”為適應干熱環境而發生CYP11B2基因C-344T位點向攜帶T等位基因的基因型增多的趨勢突變。這同時也表明塔克拉瑪干“沙漠人”熱習服生理特性與CYP11B2基因C-344T多態性相關聯。

另外，本研究還可以對既往研究中ACE、CYP基因與糖尿病、高血壓、高血脂關系報道不一的現象［8］有所啟示:在研究基因突變與疾病關系時還要考慮環境因素引起的基因突變。

［1］韓建康，劉業祥，劉永健.塔克拉瑪干沙漠周邊地區20世紀前半葉夏季氣溫趨勢變化［J］.干旱區地理，2007，30(1):36-37.

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［3］Marie E，Sandstr?m·Jason C，Siegler·Ric J，et al.The effect of 15 consecutive days of heat-exercise acclimation on heat shock protein 70 cell ［J］.Stress and Chaperones，2008，13(2):169-175.

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［5］Hautanen A，Lankinen L.Associations between aldosterone synthase gene polymorphism and the adrenocortical function in males［J］.J Intern Med，1998，244(3):11-18.

［6］Davies E，Holloway CD，Ingram MC，et al.Aldosterone excretion rat and blood pressure in essential hypertension are related to polymorphic differences in the aldosterone synthase gene CYP11B2 ［J］.Hypertension，1999，33(8):703-707.

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