“Turn-on”型磷光Hcy/Cys納米探針的制備與性質研究

劉湘梅 劉淑娟 楊會然 于海霞 汪靜霞 翟 釗 趙 強 黃 維

“Turn-on”型磷光Hcy/Cys納米探針的制備與性質研究

劉湘梅 劉淑娟 楊會然 于海霞 汪靜霞 翟 釗 趙 強＊黃 維＊

(南京郵電大學信息材料與納米技術研究院，有機電子與信息顯示國家重點實驗室培育基地，南京 210046)

在本工作中，我們以制備純水相檢測的納米探針為目標，以二氧化硅納米粒子作為載體，以含特異性檢測基團的長發光壽命的磷光銥配合物作為信號單元，通過共價鍵接枝方法得到幾種納米探針。采用SEM、TEM、SAXRD和氮氣吸附等表征方法對納米探針的表面形貌和內部結構進行表征，并用磷光發射光譜研究基于不同載體所得到的納米探針的光物理性質以及對高半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)的響應性，最后通過理論計算對其響應機理進行探討。實驗結果表明，以MCM-41作為載體的雜化納米探針具有更強的發光強度和更好的響應性，并且在純水體系中實現了對半胱氨酸和高半胱氨酸的高選擇性檢測。

磷光納米探針；二氧化硅納米粒子；磷光重金屬配合物；生物傳感

生命科學的迅速發展要求人們從單細胞和單分子水平上原位、活體、實時地了解物質之間的相互作用以及生命的過程。光學成像具有成像迅速、連續實時監測、無創性或微創性、可同時觀察多分子事件、無放射性損傷、探針可重復導入以及不需要切片可進行原位活體成像等優點，是醫學成像研究中應用最廣泛的一種分子成像方法。

目前用于生物成像的光學探針主要包括熒光蛋白和生物發光蛋白類、有機染料[1-6]以及量子點類[7]。其中熒光蛋白和生物發光蛋白特異性識別很好，但是價格昂貴并且容易失去活性結合位點而限制了其進一步的臨床應用；有機染料尤其是有機熒光染料的水溶性、光穩定性以及生物相容性方面還存在一些局限[8]；量子點類探針其潛在毒性也令人擔憂。磷光重金屬配合物由于具有室溫下高的三線態光量子效率、大的斯托克斯位移、較長的發射壽命、可見區激發、良好的光化學穩定性以及發射波長易調節等優點，近期在生物成像領域的應用備受關注[9-13]。

二氧化硅納米粒子由于具有很好的生物相容性、表面易修飾、高比表面積以及制備簡單可控等優點，常被用來作為發光材料載體制備光學探針，該設計策略能增強探針的親水性能，可以避免為引入親水基團而進行的繁瑣的有機合成步驟[14-15]。另外，由于二氧化硅載體材料具有有效的 “透明”優點，它們在近紅外區、可見光和紫外區均不發生光吸收，從而能保持雜化材料中發光染料的光物理性質，因而在光學成像探針領域引起廣泛關注。目前已經有一些關于發光納米粒子成像探針的報道，但是其中大部分工作都僅僅是用商業熒光材料作為信號單元，而基于長壽命磷光信號的雜化探針尤其是即具有發光功能又具有檢測功能的二氧化硅雜化納米探針報道較少[16-19]。

在本工作中，我們將磷光重金屬銥配合物通過共價鍵引入到不同類型的二氧化硅納米粒子中，得到有機無機雜化納米探針，用于檢測高半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)。 通過 SEM、TEM、XRD 以及N2吸附表征納米探針的形貌和結構，通過磷光光譜測試其對高半胱氨酸和半胱氨酸的響應性。

1 實驗部分

1.1 納米粒子載體的合成

實心納米粒子按照經典的St?ber方法制備[20]。將100 mL乙醇和5 mL氨水混合，常溫攪拌下滴加3 mL正硅酸乙酯(TEOS)，繼續攪拌12 h，離心分離洗滌備用。MCM-41的制備根據文獻報道的制備方法，采用表面活性劑CTAB做模板劑(0.2 g)，水(96 mL)作為反應介質，TEOS 作為硅源(1.2 mL)，NaOH(0.7 mL，2 mol·L-1) 作為催化劑，通過水解縮合合成[21]。SBA-15的制備以三段共聚物P123為模板劑，TEOS為硅源，在酸性條件下合成介孔納米粒子SBA-15，其原料物質的量比組成為：nP123∶nHCl∶nH2O∶nTEOS=0.017∶5.88∶197∶1[22]。

1.2 銥配合物雜化納米探針的合成

銥配合物雜化納米探針的合成分為4步，如圖1所示。第一步，N^N配體的合成，反應產物用乙醇重結晶后，得黃色針狀固體 (76%)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)9.21(d，1H)，8.95(d，1H)，8.28(d，1H)，7.99(d，1H)，7.66(dd，1H)，7.52(dd，1H)，6.9(s，1H)，4.3(s，2H)。第二步，銥配合物的合成，銥的二氯橋化合物根據文獻方法合成[23]。稱取銥二氯橋化合物0.15 mmol和 5-氨基-1,10-鄰菲咯啉 0.375 mmol加入到反應瓶中，再加入15 mL CH2Cl2和甲醇的混合溶劑(2∶1，V/V)，磁力攪拌回流 3～5 h 后，降至室溫，加入5倍當量的六氟磷酸鉀(KPF6)，繼續攪拌約1 h后，減壓旋蒸除去溶劑，將所得固體混合物再溶于約10 mL的CH2Cl2中，將不溶物過濾除去，濾液減壓旋蒸除去溶劑后得到固體，用柱層析方法(二氯甲烷/丙酮)過柱提純，得到棕黃色固體，產率為63%，配合物通過1H NMR進行表征。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)9.78(d，2H)，9.03(d，1H)，8.40～8.43(dd，3H)，8.18 ～8.21(dd，2H)，8.15(d，1H)，7.99 ～8.03(t，2H)，7.93～7.96(dd，1H)，7.72(d，1H)，7.67～7.69(dd，1H)，7.54～7.60(m，4H)，7.15～7.20(m，2H)，7.11(s，1H)，6.97(s，2H)，6.75(d，1H)，6.72(d，1H)。 第三步，用異氰酸丙基三乙氧基硅烷對銥配合物功能化。取銥配合物(0.03 mmol)于圓底燒瓶中，抽真空充氮氣，在氮氣保護下用注射器注入經除水處理的四氫呋喃5 mL充分溶解后，再注入異氰酸丙基三乙氧基硅烷150 μL(2.5 mmol)，70 ℃加熱回流 24 h，然后加入冷正己烷沉降。通過離心分離，再迅速將下層沉淀溶解于3 mL無水四氫呋喃兩次沉降/離心/溶解除去未反應的異氰酸丙基三乙氧基硅烷。第四步，將該產物溶解在無水四氫呋喃中，分別加入到含SBA-15、MCM-41以及實心納米粒子的四氫呋喃懸浮液中，反應24 h，離心洗滌，干燥，得到有機無機雜化納米粒子。通過硅酯鍵與二氧化硅表面的硅醇羥基水解縮合共價鍵連接，這樣防止染料分子的泄露，提高穩定性。

1.3 實驗儀器和表征方法

核磁共振譜用Bruker AdvanceⅢ (400 MHz)型核磁共振儀在室溫下測定；質譜用Bruker autoflex基質輔助激光解吸離子化時間-飛行時間質譜儀(MALDI-TOF/TOF)測定；掃描電子顯微鏡(SEM)觀察(日立S-4800場發射掃描電鏡，10 kV操作電壓)；透射電子顯微鏡(TEM)觀察(JEOL JEM-2100，加速電壓為150 kV)。氮氣吸附-脫附測量(3H-2000PS2表面積分析儀，北京貝士德儀器公司)。通過吸附在p/p0=0.04～0.20 收集 6 個點數據計算 BET(Brunauer-Emmett-Teller)比表面積。孔徑分布采用BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方法估計。粉末小角X射線衍射(XRD)在Bruker Advance-D8衍射儀上進行測定，Cu靶，Kα輻射源。磷光發射光譜在 Shimadzu RF-5301PC光譜儀上測定；熱重分析在SDT2960型熱重-差熱儀上測定；紅外光譜由Shimadzu IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀測定。

1.4 理論計算

所有計算都應用量子化學通用的計算程序Gaussian03完成[24]。采用B3LYP(Becke型3參數密度泛函模型，此模型采用Lee-Yang-Parr泛函)密度泛函理論(DFT)對配合物的結構進行優化來計算配合物以及與半胱氨酸反應后的產物的單線態和最低的三線態(T1)能級。采用LANL2DZ基組處理銥原子的核心電子，而6-31G*基組被用來處理配合物中所有其它原子。在優化三線態結構基礎上采用時間密度泛函理論(TD-DFT)來計算配合物的激發態。計算結果給出了HOMO、LUMO以及LUMO+1等的軌道分布。

1.5 半胱氨酸和高半胱氨酸檢測實驗

對Hcy和Cys的檢測我們是在PBS緩沖液(pH值7.4)中通過光度法測定。通常情況下，測試前先將不同濃度的氨基酸和雜化納米粒子懸浮液在37℃反應15 min后測試其發射強度，其中納米粒子的濃度為1 mg·mL-1。激發波長為365 nm，狹縫寬度為5 nm。

2 結果與討論

2.1 配體以及配合物表征

圖1所示N^N配體1和銥配合物2通過1H NMR和MALDI-TOF-MS進行表征。功能化配合物3的質譜碎片峰如圖2所示，實驗結果證明，銥配合物N^N配體上的NH2與-CNO反應。從不同階段的紅外光譜(如圖3)我們可以看出，銥配合物與異氰酸丙基三乙氧基硅烷反應后，Ir-Si(OEt)3紅外光譜在1 600 cm-1的吸收證明酰胺鍵(CONH)的生成。與納米粒子接枝后，Ir-MCM紅外光譜出現了銥配合物在1 500～1 700 cm-1的吸收峰和MCM-41的特征峰，證明在雜化探針中銥配合物的存在。通過TGA測試得到雜化納米粒子(Ir-MCM)中配合物的含量約為47%。

2.2 二氧化硅納米粒子的形貌表征

圖4a是所得到的實心納米粒子透射電鏡圖。從圖中我們可以看出，納米粒子的平均直徑約為80 nm。圖4b是所得到的MCM-41的透射電鏡圖。從圖中我們可以看出，所制備的MCM-41納米粒子粒徑約為80～100 nm，從高倍透射電鏡圖(圖4b插圖)我們可以看出內部孔道成規則六方緊密堆積。圖4c和圖4d分別是所得到的SBA-15的掃描電鏡和透射電鏡圖，SBA-15長徑比比較大，并且內部孔道直徑相對MCM-41更大。

2.3 雜化納米粒子對Hcy和Cys的響應性

在本工作中，我們研究了幾種不同結構的雜化納米粒子的光物理性質以及對Hcy和Cys的響應性。我們分別采用SiO2實心納米粒子、MCM-41以及SBA-15作為載體，制備雜化納米粒子，分別標為Ir-NPs、Ir-MCM以及Ir-SBA，并研究其雜化納米粒子的光物理性能。從圖5a我們可以看出，雜化納米粒子的發射波長在565 nm附近，在相同的質量濃度下，Ir-MCM的發光強度明顯比Ir-NPs強，這可能是因為MCM-41的比表面積比較大，所負載的銥配合物分子比較多，并且我們測試了雜化納米粒子(Ir-MCM)的磷光壽命為321.42 ns。當加入半胱氨酸后，從圖5b、5c和5d我們可以看出，Ir-NPs由于比表面積相對較低，響應性也比較低；而Ir-SBA由于SBA-15粒徑比較大，光散射比較強(圖5d)，也不適合作為本體系的探針載體。因此，通過本實驗我們篩選出對半胱氨酸的響應性最大的Ir-MCM雜化粒子作為探針做系統研究。

2.4 Ir-MCM雜化納米探針的結構表征

以MCM-41作為載體的雜化納米粒子的表面結構以及內部孔道結構通過SEM、TEM、XRD和氮氣吸附-脫附等溫線進行表征。圖6是所制備的負載前(MCM)(圖6a和圖6c)和負載銥配合物后的(Ir-MCM)納米粒子(圖6b和6d)的透射電鏡和掃描電鏡圖片。

對比圖6a和圖6b我們可以看出，負載前的MCM-41粒徑約為80 nm，并且比較分散，內部孔道呈二維六方緊密排列，孔道與孔壁具有很明顯的對比度，證明所得到的MCM內部孔道清晰可見并且長程有序。當負載銥配合物后，雜化納米粒子(Ir-MCM)沒有明顯聚集，粒子界面沒有負載前清晰，而且內部孔道也沒有負載前(圖6a)清晰，這證明探針分子已經被接枝到介孔納米粒子的內孔壁和外部表面上。動態光散射粒徑分析結果表明，負載前(如圖7a)的納米粒子單分散性比較好，粒徑約74 nm，粒徑分布很窄。負載銥配合物后(如圖7b)，雜化納米粒子粒徑90 nm，粒徑分布相對較寬，尤其是在350 nm附近的粒子可能是由于有機配合物負載過程中造成少部分納米粒子團聚造成。

X-射線衍射是利用衍射圖中的衍射峰位置和強度來測定晶格常數和晶型，利用衍射峰的角度及峰形測定晶粒的直徑和結晶度。介孔材料在XRD譜圖上，只有2θ在2°～10°的低角度區有明顯的衍射峰，其強度可作為判斷介孔材料有序度的基本手段之一。圖8是所得到的MCM和Ir-MCM的XRD結果。從圖中可以看出，在MCM樣品中觀察到(100)面的強峰和(110，200)2個弱峰，這可以說明該介孔納米粒子具有二維六方緊密堆積的內部結構，并且孔道長程有序規則。負載銥配合物后，Ir-MCM樣品的(100)面的峰值強度下降，而(110，200)面的峰變得不再明顯，這表明負載銥配合物后，雜化納米粒子的內部介孔結構還是存在，但是有序度有些降低，而且因為介孔的孔壁接枝銥配合物后，可能也導致衍射襯度降低，從而峰強度降低。

氮氣吸附-脫附等溫線也是表征介孔材料結構特征的重要手段。如圖9所示，所制備的負載前MCM和負載后的Ir-MCM納米粒子的氮氣吸附-脫附等溫線的形狀，按照IUPAC的劃分屬于典型Ⅳ的等溫線[25]。本工作中的負載前的樣品所得到的滯后環屬于 H1 型，相對壓力 p/p0=0.28～0.4，反映了該材料的內部孔道比較規則，孔徑具有相對窄的孔徑分布，用 BET(Brunauer-Emmett-Teller)法計算后得到MCM 比表面積為 898.43 m2·g-1， 孔容為 1.20 cm3·g-1。當負載銥配合物后，Ir-MCM的等溫線具有較低的氮氣吸附量，而且滯后環不清晰，根據等溫線數據計算后得到Ir-MCM的比表面積和孔容分別為600.35 m2·g-1和 0.87 cm3·g-1， 這些結果表明，MCM的內部孔道表面被成功接枝了銥配合物。

MCM和Ir-MCM的孔徑分布根據樣品的吸附－脫附等溫線采用BJH方法進行計算。MCM和Ir-MCM的孔徑分布如圖10所示，MCM的平均孔徑為2.90 nm，而且該材料的孔徑分布很窄。當接枝銥配合物后，Ir-MCM的BJH孔徑下降至2.53 nm，而且孔徑分布相對較寬，小孔徑孔道所占比例相對較多，這可能是由于銥配合物的負載，MCM內部孔隙部分被配合物占據，而在相對較大孔徑區域的孔可能是由于銥配合物在MCM表面部分團聚形成的堆積空隙造成。總的來說，負載后的納米粒子的比表面積、孔容和孔徑都降低，并且孔徑分布較寬的出現，這也進一步證實了探針分子銥配合物在MCM內孔壁和外表面的接枝。

2.5 光物理性質

納米探針在水中具有很好的分散性是其在實際生物檢測中實現應用的先決條件。本工作中所合成的MCM納米粒子和雜化納米探針Ir-MCM在水中均有很好的穩定性。我們將納米探針Ir-MCM分散在PBS緩沖溶液中，懸浮液呈現橙紅色，用365 nm激發波長激發，懸浮液的發射波長在565 nm(如圖11)，該峰比較寬，說明該納米粒子的發射峰能量來自CT態躍遷。當加入不同濃度的半胱氨酸或者高半胱氨酸后(n氨基酸/n配合物=0～200 eq.)，懸浮液的發射波長位置沒有發生明顯移動，但是發射峰明顯增強(如圖 11)。

而在同樣的探針濃度下，加入其它氨基酸如L-組氨酸、L-亮氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-羥脯氨酸、L-絲氨酸和 L-苯丙氨酸，沒有觀察到明顯變化。當用紫外燈(365 nm)照射時，加入半胱氨酸的樣品用肉眼可以觀察到亮度明顯增加(圖11插圖)，加入高半胱氨酸也有同樣的現象。

根據文獻報道[1,15-16,26-27]和以上的實驗現象，我們提出一種可能的響應機理(圖12)。銥（Ⅱ）配合物中環金屬配體帶的醛基能與β-和γ-烷基巰基類氨基酸如Hcy和Cys形成相應的五元雜環((thiazolidine)或六元雜環(thiazinane)。為進一步了解反應機制，我們用TDDFT計算方法計算出醛基對配合物的光物理性質影響。我們選取帶硅酯基的配合物(Ir-Complex)以及配合物與半胱氨酸反應后的產物(Ir-Cys)在水相中的基于最低三線態(T1)結構來計算分子前線軌道分布，根據軌道分布來驗證所提出的反應機理。

表1 配合物Ir-Complex和配合物Ir-Cys的前線軌道分布Table 1 HOMO,LUMO and LUMO+1 distributions of Ir-Complex and Ir-Cys at the triplet states

表2 理論計算得到的配合物Ir-Complex和配合物Ir-Cys在水溶液中最低三線態能級Table 2 Calculated phosphorescence emissions of Ir-Complex and Ir-Cys in aqueous solution with TDDFT method

如表1所示，配合物Ir-Complex的最高占據分子軌道 (HOMO)主要分布在2個C^N配體的苯環上，以及少量分布在C^N配體的吡啶環和金屬中心Ir上；而最低空分子軌道(LUMO)主要分布在輔助配體N^N配體上。配合物Ir-Cys的HOMO主要分布在Ir和C^N配體的苯環和C^N配體醛基與半胱氨酸的巰基形成的五元雜環上；LUMO主要分布在N^N配體上，少量分布在Ir金屬中心上。

HOMO-4主要分布在一個C^N配體醛基與半胱氨酸的巰基形成的五元雜環上，少量分布在另一個C^N配體的苯環上和Ir金屬中心上；LUMO+1主要分布在輔助配體N^N上；HOMO-5分布在其中一個C^N配體，另一個C^N配體的苯環和吡啶以及銥金屬中心分布相對較少。如表2所示，配合物Ir-Complex的最低能量三線態主要來自HOMO→LUMO(59%)的躍遷，根據軌道分布進一步證明了三線態金屬-C^N配體的電荷轉移 (dπ(Ir)→π*C^N]3MLCT)和三線態配體內電荷轉移 ([πC^N→π*N^N]3LLCT)參與其中。相比之下，配合物Ir-Cys的最低能量三線態主要來自HOMO→LUMO(37%)、HOMO-5→LUMO+1(31%)和 HOMO-4→LUMO+1(43%)的躍遷。計算結果進一步證實金屬-C^N配體電荷轉移([dπ(Ir)→π* 的 C^N]3MLCT)，三線態配體間電荷轉移([πC^N→π*N^O]3LLCT)以及C^N配體醛基與半胱氨酸的巰基形成的五元雜環也參與配體間的電荷轉移躍遷。因此，這是造成探針光譜變化的原因。

3 結 論

我們選擇具有很好親水性和生物相容性的二氧化硅實心納米粒子、介孔納米粒子如SBA-15和MCM-41作為銥配合物載體，設計合成了對半胱氨酸和高半胱氨酸具有高選擇性的磷光納米探針。實驗結果表明，由于MCM-41相比其它幾種載體兼備高比表面積和尺寸適中的粒徑優勢，從而使得到的雜化納米探針具有更強的發光強度和更好的響應性。基于MCM-41的雜化探針實現了在純水體系中檢測半胱氨酸，減少了復雜的有機合成步驟，提高了磷光配合物的利用率，降低了成本。該設計策略為以后在實際應用如細胞成像和生物傳感領域開發優異的磷光細胞探針能提供有效途徑。

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“Turn-on” Phosphorescent Nanoprobes for Sensing Homocysteine and Cysteine

LIU Xiang-MeiLIU Shu-Juan YANG Hui-Ran YU Hai-Xia WANG Jing-XiaZHAI ZhaoZHAO Qiang＊HUANG Wei＊
(Key Laboratory for Organic Electronics&Information Displays(KLOEID);Institute of Advanced Materials,Nanjing University of Posts&Telecommunications,Nanjing 210046,China)

In this work,we designed and fabricated a series of new nanoprobes by using the high specific surface area and good biocompatibility of mesoporous silica nanoparticles as a probe carrier and the long lifetime luminescence of phosphorescent complexes as signal unit.The structures and physical properties of prepared nanoprobes were characterized by SEM,TEM,XRD and nitrogen adsorption/desorption isotherms.Spectrophotometric determination was performed in phosphate buffer saline(PBS)buffer for Hcy/Cys sensing.To further understand the response mechanism,the effect of the aldehyde(CHO)group on the photophysical properties was calculated by using TDDFT calculation method.The result demonstrated that the as-prepared nanoprobe exhibited high selectivity for Hcy and Cys in pure PBS,which provides the advantage in developing excellent phosphorescent cellular probes for practical applications.

silica nanoparticles;phosphorescence nanoprobes;iridium complexes;biosensor

O614.82；O613.72

A

1001-4861(2012)11-2271-09

2012-05-15。收修改稿日期：2012-06-15。

國家自然科學基金(No.61006007)，中國博士后科研課題(No.20100471354)，江蘇省博士后科研課題(No.1002024C)資助項目。

＊通訊聯系人。 E-mail：iamqzhao@njupt.edu.cn，iamwhuang@njupt.edu.cn，電話：+86-+86(25)85866008