人臍血內皮祖細胞的體外培養

王明勇 李 燕 宋淑敏 彭 強▲

1.瀘州醫學院附屬醫院醫學實驗中心，四川瀘州 646000；2.瀘州醫學院附屬醫院小兒外科，四川瀘州 646000

人臍血內皮祖細胞的體外培養

王明勇1李 燕1宋淑敏2彭 強2▲

1.瀘州醫學院附屬醫院醫學實驗中心，四川瀘州 646000；2.瀘州醫學院附屬醫院小兒外科，四川瀘州 646000

目的 從人臍帶血中分離內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs），建立人臍血內皮祖細胞體外培養的方法，為實現內皮祖細胞的移植及實驗研究提供足量的細胞來源。 方法 采用密度梯度離心法分離人臍帶血內皮祖細胞，在EGM-2培養基中培養，采用流式細胞儀、免疫組化和免疫熒光鑒定EPCs。 結果 臍帶血單個核細胞在經EGM-2培養過程中出現梭形貼壁和鋪路石樣等形態；1周后既分化成EPCs，細胞免疫熒光CD133染色率在培養第7天為（67.2±2.12）%，免疫組化CD34染色率為（89.67±2.05）%，流式細胞儀鑒定該種細胞CD133與KDR的雙陽性率達87.8%。可確定該細胞為EPSc。 結論 采用本培養方法可獲得良好的內皮祖細胞用于實驗研究。

細胞培養技術；單個核細胞；人臍血；內皮祖細胞

自1997年Asahara等[1]首次在成人外周血分離到循環內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）以來，此后又陸續在骨髓、臍帶血和其他軟體組織中發現EPCs[2]。內皮祖細胞是來源于骨髓、外周血及臍帶血和其他軟體組織在外周血中循環，并能增殖分化為成熟的內皮細胞的一類前體細胞[3]。從臍帶血中分離獲取EPCs進行體外培養，較從骨髓、外周血和其他軟體組織獲取EPCs的量更多，損傷和風險更小，雖然從外周血中分離EPCs也很方便，但其含量僅為從臍帶血中分離EPCs量的十分之一[4-7]。本實驗通過密度梯度離心得到單個核細胞后，通過添加一些細胞因子進行體外培養，從而誘導和促進EPCs的分化，以獲得足夠的EPCs用于實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人淋巴細胞分離液（Ficoll-Hv-qapue，密度1.077 g/mL，天津市灝洋生物制品有限公司）；EGM-2培養基 （Lonza，美國）；胎牛血清（Hyclone，美國）；血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子 （bFGF）和胰島素樣生長因子（IGF-1）均為美國Peprotech公司產品；纖維連接蛋白（FN，Sigma，美國）；兔抗人 CD133 單克隆抗體（Santacruz，美國）；鼠抗人CD34（epitomics，美國）；FITC標記鼠抗人單克隆血管內皮因子受體-2（VEGFR-2）（KDR）抗體，PCY 標記鼠抗人CD133（Becman Coulter，美國）。X-60倒置相差顯微鏡（Nikon，日本）；AX70 熒光顯微鏡及圖像采集儀（Olympus，日本）；流式細胞儀（Becman Coulter，美國）。

1.2 方法

1.2.1 臍血內皮祖細胞的分離 無菌條件下取正常剖宮產胎盤中的臍帶血50 mL（均簽署知情同意書并獲我院倫理委員會同意）。臍血中加入肝素（20 U/mL）抗凝，室溫靜置30～60 min。盡量吸取上清液到含有5 mL PBS緩沖液的試管中混勻；每個10 mL管中加入淋巴細胞分離液2 mL，然后加入混勻的臍血上清液4 mL；將試管放入水平離心機，2 000 r/min離心20 min；吸取呈乳白色的第2層細胞（單核細胞層）加入到含4 mL PBS液中混勻，1 200 r/min離心10 min；棄上清液，加入3 mL PBS液，混勻沉淀，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入適量的培養基 （EGM-2+20%胎牛血清+50 ng/mL VEGF+20 ng/mL bFG F+20 ng/mL IGF-1）吹打混勻。

1.2.2 臍血內皮祖細胞的培養 分離的單核細胞以1×105/cm2接種于纖維連接蛋白包被的12.5 mL培養瓶中；37℃、5%CO2、飽和濕度中培養；第3天半量換液，此后每2～3 d全量換液1次。

1.2.3 血管內皮祖細胞的鑒定 ①形態學觀察：前2 d靜置培養細胞，從第3天開始觀察。②免疫細胞化學染色：用0.02%EDTA消化培養7 d細胞，制成細胞涂片，采用SABC法，對細胞涂片的CD34進行免疫細胞化學染色，DAB顯色，PBS液代替一抗作陰性對照，以細胞質出現棕黃色顆粒為CD34陽性細胞。③免疫熒光染色：用0.02%EDTA消化培養7 d細胞，制成細胞涂片，細胞經4%多聚甲醛固定，10%BSA封閉后，加入兔抗人CD133單克隆抗體（1∶100），陰性對照只加血清，37℃孵育60 min，PBS洗滌，加入FITC標記的熒光素二抗（1∶50），37℃孵育 30 min，PBS 洗滌，干燥，封片，熒光顯微鏡觀察，顯示綠色熒光的細胞為CD133陽性細胞。④流式細胞檢測：用0.02%EDTA消化培養7 d細胞，制成1×106/L細胞懸液，分別加入FITC標記鼠抗人單克隆血管內皮因子受體-2（VEGFR-2）（KDR）抗體，PCY 標記鼠抗人 CD133 抗體各20 μL避光室溫反應30 min，然后上機檢測，分析KDR和CD133共表達情況。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

在培養第3天可見約40%貼壁細胞為梭型；第4～5天貼壁細胞出現細胞集落，周圍細胞以集落為中心，呈發芽式向外生長，周圍為呈放射狀分布的梭形細胞（圖1）；8～10 d出現“鋪路石樣”形似鵝卵石的單層細胞（圖2）。

2.2 免疫細胞化學染色

CD34免疫組化染色顯示（89.67±2.05）%培養7 d細胞為陽性。

2.3 免疫熒光染色

CD133免疫熒光染色顯示（67.2±2.12）%培養7 d細胞為陽性。

2.4 流式細胞檢測

流式細胞分析培養7 d細胞KDR和CD133的表達率共達87.8%。

3 討論

有研究認為血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞因子（bFGF）、胰島素樣生長因子（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）對內皮祖細胞有調控作用，能促進內皮祖細胞的體外生長[8-9]。這些生長因子用于培養內皮祖細胞的使用劑量和使用的種類，各個實驗室各不相同，本實驗采用3種生長因子進行體外內皮祖細胞的培養：VEGF使用濃度為50 ng/mL，bFGF為 20 ng/mL，IGF-1為 20 ng/mL。

體外分離內皮祖細胞的方法主要有免疫磁珠、流式細胞術和密度梯度離心法，前兩種雖然可獲得高純度的細胞，但其回收內皮祖細胞的量少且操作復雜，費用昂貴。通過預試驗我們對采取經過靜置30～60 min的抗凝臍血上清液 （血漿）和采用抗凝臍血與PBS緩沖液1∶1稀釋后的血液分別用密度梯度離心法獲得的單個核細胞通過顯微鏡觀察比較，發現用靜置臍血血漿分離獲得的單個核細胞中的紅細胞含量遠遠少于用PBS緩沖液與臍血 1∶1稀釋后的血液分離獲得的單個核細胞中的紅細胞含量，且用靜置臍血血漿分離獲得的單個核細胞進行內皮祖細胞培養發現細胞貼壁情況比用PBS緩沖液與臍血 1∶1稀釋后的血液分離獲得的單個核細胞進行內皮祖細胞培養的貼壁情況要好。因此，本實驗采用密度梯度離心法從靜置30～60 min的抗凝臍血上清液 （血漿）中獲得單個核細胞用于內皮祖細胞的體外培養。

內皮祖細胞的培養方法主要有：一種方法是將獲得的單個核細胞接種到預先鋪有纖維連接蛋白的培養板中，24 h后將未貼壁的細胞重新接種到新的鋪有纖維連接蛋白的培養板中繼續培養[1]；另一種方法是將單個核細胞接種到培養板中，培養4 d后棄掉未貼壁的細胞，留下的貼壁細胞繼續培養[10]；還有一種是把單個核細胞接種到鋪有Ⅰ型膠原的培養板中，然后棄掉未貼壁的細胞，貼壁細胞繼續培養[11]。纖維連接蛋白可促進細胞的黏附，并且與VEGF協同可提高內皮祖細胞的遷移和分化[12]，因此本實驗采用的內皮祖細胞培養方法是將獲得的單個核細胞接種到鋪有纖維連接蛋白的培養瓶中，靜置培養3 d后棄去未貼壁的細胞，貼壁細胞繼續培養。

內皮祖細胞的的鑒定觀點不一。有人把表達CD34和KDR 的認為 EPCs[1]；有些學者認為 CD34、CD133、KDR 是EPCs特征性標志[13]；也有學者把EPCs分為兩類，早期EPCs（CD34+、CD133+、KDR+），晚期 EPCs（CD34+、CD133－、KDR+）[14-16]。

通過對本實驗培養的內皮祖細胞鑒定發現：細胞免疫熒光CD133染色率在培養第7天為 （67.2±2.12）%，免疫組化CD34染色率在培養第7天為（89.67±2.05）%，流式細胞儀鑒定該種細胞在培養第7天CD133與KDR的雙陽性率達87.8%?？纱_定為EPCs，采用本方法可獲得良好的內皮祖細胞用于實驗研究。

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Cultivation in vitro of people umbilical cord blood endothelial progenitor cells

WAMG Mingyong1LI Yan1SONG Shumin2PENG Qiang2▲
1.Medical Experiment Center,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Sichuan Province,Luzhou 646000,China;2.Department of Pediatric Surgery,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Sichuan Province,Luzhou 646000,China

Objective To establish a method of endothelial progenitor cells isolated from human umbilical cord blood in vitro,and to provide a sufficient amount of source for endothelial progenitor cell transplantation and experimental study.Methods Isolate from human umbilical cord blood endothelial progenitor cells with density gradient centrifugation,and culture in EGM-2 medium.EPCs were identificatd by flow cytometry and immunofluorescence.Results The cells cultured in EGM-2 were displayed spindle-shaped and cobble-stone morphology,and differentiated into EPCs a week later.The rate of CD133 immunofluorescence staining was(67.2±2.12)%on seven days.The rate of CD34 Immunohistochemical staining was(89.67±2.05)%on seven days.The double positive rate of CD133 and KDR was 87.8%in these cells.It could determine that the cell was EPSc.Conclusion We can obtain available endothelial progenitor cells using this culture method for experimental research.

Cell culture technology;Mononuclear cells;Human umbilical cord blood;Endothelial progenitor cells

R329.23

C

1673-7210（2012）05（a）-0032-03

國家自然科學基金資助項目（30700876）；四川省教育廳資助項目（2006B026）。

▲通訊作者

2012-02-20 本文編輯：馮 婕）