海洛因中毒者血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量的測定

武文杰 郭相杰 郭紅民 楊 凱 高彩榮

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.太原市公安局迎澤分局，山西太原 030001

海洛因中毒者血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量的測定

武文杰1，2郭相杰1郭紅民2楊 凱1高彩榮1

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.太原市公安局迎澤分局，山西太原 030001

目的 探討海洛因中毒為代表的非變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)患者血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶的含量變化及其機(jī)制。 方法 對照組為22名正常人，實(shí)驗(yàn)組1為19例海洛因中毒者，實(shí)驗(yàn)組2為20例顱腦外傷患者，實(shí)驗(yàn)組3為22例初發(fā)急性心肌梗死患者。應(yīng)用ELISA方法檢測對照組和實(shí)驗(yàn)各組血漿胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量。 結(jié)果 三組實(shí)驗(yàn)組與對照組比較血漿胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即實(shí)驗(yàn)組血漿類胰蛋白酶和類糜蛋白酶含量較對照組均升高，而三組實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 海洛因中毒、顱腦創(chuàng)傷與心肌梗死者血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量均增加，提示在非變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)及上述兩種疾病患者均伴有肥大細(xì)胞脫顆粒或溶解，類胰蛋白酶和類糜蛋白酶含量升高可以作為非變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)的診斷依據(jù)之一，但應(yīng)排除急性心肌梗死和顱腦損傷，或者聯(lián)合其他指標(biāo)綜合判斷。

類胰蛋白酶；類糜蛋白酶；海洛因中毒；顱腦創(chuàng)傷；急性心肌梗死

嚴(yán)重過敏反應(yīng)（anaphylaxis）是一種嚴(yán)重的、危及生命的全身性超敏反應(yīng)，除IgE介導(dǎo)機(jī)制以外，還存在非IgE介導(dǎo)免疫機(jī)制，包括IgG抗體免疫復(fù)合物、補(bǔ)體相關(guān)性和凝血系統(tǒng)的激活[1-2]，新的命名方法將上述途徑發(fā)生的過敏反應(yīng)統(tǒng)稱為變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)。與其免疫機(jī)制不同的是非免疫途徑機(jī)制，包括運(yùn)動、冷空氣或冷水等物理及化學(xué)性的直接刺激和一些藥物，如嗎啡、海洛因以及增溶劑、造影劑、麻醉劑、脂質(zhì)體等作用。最新調(diào)查研究表明，臨床發(fā)生的急性嚴(yán)重過敏反應(yīng)約77%為此類型[3]。非免疫途徑機(jī)制是通過引起肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒從而誘發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng)。Jeziorska[4]在研究人頸動脈粥樣斑塊時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常內(nèi)膜相比，斑塊處的肥大細(xì)胞數(shù)量升高，并處于脫顆粒狀態(tài)；而Erik等[5]在對創(chuàng)傷死亡者血清類胰蛋白酶的研究中，發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶含量升高。為此本文選取海洛因中毒者作為類過敏反應(yīng)的研究對象，另收集正常人群、顱腦創(chuàng)傷及急性心肌梗死患者血漿，采用ELISA夾心法對上述患者的血漿類胰蛋白酶和類糜蛋白酶含量進(jìn)行檢測，探討類過敏反應(yīng)與上述三種情況之間兩指標(biāo)的區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 材料

對照組收集健康人血漿22份，由太原市江陽工廠醫(yī)院體檢中心提供；實(shí)驗(yàn)組包括海洛因成癮者血漿19份，由太原市戒毒所提供，顱腦創(chuàng)傷者血漿20份，由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院提供及初發(fā)心肌梗死患者血漿22份，由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院提供，分別作為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3。各組年齡最大值及最小值分別為對照組最大75歲，最小23歲；實(shí)驗(yàn)組1最大49歲，最小21歲；實(shí)驗(yàn)組2最大72歲，最小12歲；實(shí)驗(yàn)組3最大67歲，最小38歲。各組年齡段分布見表1。

由表1可見，對照組各年齡段隨機(jī)分布，實(shí)驗(yàn)組的年齡段分布符合該組發(fā)病（發(fā)生）規(guī)律。吸毒人員主要集中在青壯年，顱腦外傷患者主要由意外、車禍及暴力等原因造成，各年齡段均有分布，以男性為主，初發(fā)心肌梗死患者多發(fā)于中老年，也有發(fā)病年輕化的趨勢。

1.2 酶聯(lián)免疫法測定血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量

人類胰蛋白酶及類糜蛋白酶檢測試劑盒購于北京索來寶公司。ELISA試驗(yàn)測定所用儀器為第四軍醫(yī)大學(xué)的DG3022酶聯(lián)免疫檢測儀。

各組抽取全血后立即2 000 r/min離心20 min，收集上層血清，置-70℃凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂们笆覝貜?fù)融混勻。

ELISA操作步驟：①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，每兩孔為同一濃度，制備類胰蛋白酶濃度分別為 4 800、3 200、1 600、800、400 ng/L， 糜蛋白酶濃度為300、200、100、50、25 ng/L 的標(biāo)準(zhǔn)樣。 ②加樣：每個(gè)指標(biāo)檢測設(shè)立兩個(gè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）及待測樣品孔，每孔加稀釋度5倍待測樣品50 μL，輕晃混勻。③溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。④洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。⑤加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。⑥重復(fù)③④步驟。⑦顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。⑧終止：每孔加終止液50μL，輕輕混勻30 s，確定藍(lán)色變?yōu)辄S色。⑨終止反應(yīng)后15min以內(nèi)進(jìn)行測定，以空白對照調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組及實(shí)驗(yàn)各組類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量測定

對照組及實(shí)驗(yàn)各組類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量見表2。

由表2可見，實(shí)驗(yàn)組類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即海洛因中毒者、顱腦創(chuàng)傷及急性心肌梗死患者血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶較對照組顯著升高，但三組實(shí)驗(yàn)組間類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示上述三種情況收集的血漿，僅通過類胰蛋白酶及類糜蛋白酶兩指標(biāo)無法區(qū)分。

表1 對照組和各實(shí)驗(yàn)組年齡分布（例）

表2 對照組和實(shí)驗(yàn)組類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量測定（，ng/L）

表2 對照組和實(shí)驗(yàn)組類胰蛋白酶及類糜蛋白酶含量測定（，ng/L）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 類胰蛋白酶 類糜蛋白酶對照組（n=22）實(shí)驗(yàn)組 1（n=19）實(shí)驗(yàn)組 2（n=20）實(shí)驗(yàn)組 3（n=22）F值P值1297.1±442.6 4386.6±1467.6*4623.4±1542.6*4485.8±1985.1*98.54＜0.05 122.3±41.8 457.4±134.8*475.2±143.1*441.3±128.5*168.26＜0.05

3 討論

近年來類胰蛋白酶及類糜蛋白酶的應(yīng)用越來越受到人們的重視，特別是在過敏性休克的診斷中，常被用來作為重要的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但隨著人們對急性過敏反應(yīng)認(rèn)識的加深，發(fā)現(xiàn)非變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)以及其他多種情況均會導(dǎo)致類胰蛋白酶類糜蛋白酶升高，與肥大細(xì)胞脫顆粒及細(xì)胞膜破壞密切相關(guān)。有學(xué)者報(bào)道，除過敏反應(yīng)性疾病外，肥大細(xì)胞至少還參與了35種非變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病過程[6]。肥大細(xì)胞胞漿顆粒中除類胰蛋白酶及類糜蛋白酶等中性蛋白酶以外，還包含組織胺、羧肽酶A3和蛋白多糖等。

海洛因化學(xué)名為二乙酰嗎啡，俗稱“白面”，最早由英國Wright醫(yī)師于1874年合成，1898年德國開始規(guī)模化生產(chǎn)該藥，由于其優(yōu)良的鎮(zhèn)痛作用及強(qiáng)烈的成癮性和毒性，使其成為迄今濫用傾向最大、依賴潛力最強(qiáng)的嗎啡衍生物。海洛因中毒者臨床表現(xiàn)為昏迷、瞳孔縮小（針尖樣瞳孔）和呼吸抑制，同時(shí)出現(xiàn)心動過緩和血壓下降。有48%～80%的海洛因中毒者伴有肺水腫，癥狀表現(xiàn)與過敏反應(yīng)相似。早在1880年Osler就發(fā)現(xiàn)海洛因中毒者肺充血、水腫、出血和呼吸衰竭的病理生理表現(xiàn)[7]。海洛因在體內(nèi)的毒理作用還包括中樞神經(jīng)細(xì)胞不同程度變性、壞死、灶性血管周圍出血、急性腦水腫等，上述非特異性的類過敏樣反應(yīng)，是導(dǎo)致海洛因急性中毒死亡的主要原因。Edston等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，海洛因中毒死亡者血中嗎啡濃度低于0.2μg/mL，不能產(chǎn)生明顯呼吸衰竭，而血漿類胰蛋白酶含量的升高開始越來越受到人們重視。之后有學(xué)者用抗層粘連蛋白和膠原質(zhì)Ⅳ的抗體對海洛因中毒引起肺水腫死亡的肺標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)肺毛細(xì)血管壁周圍有類胰蛋白酶免疫染色陽性細(xì)胞出現(xiàn)，提示類胰蛋白酶與肺泡基底膜破壞有關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶的激活起關(guān)鍵作用，而肺泡基底膜的破壞是導(dǎo)致肺水腫及呼吸衰竭的重要原因[9]。作為引起非變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)代表的海洛因中毒者或死者由于非免疫機(jī)制所導(dǎo)致的肥大細(xì)胞脫顆粒引起的血漿類胰蛋白酶及類糜蛋白酶高表達(dá)，已經(jīng)越來越成為研究的重點(diǎn)。

有學(xué)者在研究類胰蛋白酶及類糜蛋白酶中發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性與類胰蛋白酶激活基質(zhì)蛋白酶有關(guān)[4]，類胰蛋白酶還可以通過促進(jìn)黏附分子表達(dá)，起到聚集炎癥細(xì)胞、促進(jìn)梗死區(qū)修復(fù)、對組織碎片吞噬和再吸收以及促進(jìn)血管再生的作用[10]；類糜蛋白酶可以通過將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ發(fā)揮心臟組織重塑作用[11]。創(chuàng)傷性休克中的血壓等生命體征變化，就與急性創(chuàng)傷刺激肥大細(xì)胞脫顆粒及破壞肥大細(xì)胞釋放出類胰蛋白酶和類糜蛋白酶等活性物質(zhì)有關(guān)，與促進(jìn)釋放兒茶酚胺、緩激肽以及其他血管活性物質(zhì)并激活補(bǔ)體系統(tǒng)也有關(guān)聯(lián)。基于此觀點(diǎn)，本試驗(yàn)除選擇海洛因中毒者外還測定了顱腦創(chuàng)傷者（實(shí)驗(yàn)組2）及初發(fā)心肌梗死患者（實(shí)驗(yàn)組3）的血漿標(biāo)本中類胰蛋白酶和類糜蛋白酶。

正常情況人體血漿類胰蛋白酶的基礎(chǔ)值為0.8～1.5 ng/mL（應(yīng)用瑞典Pharmacia&Upjohn AB公司UniCAP類胰蛋白酶FEIA檢測儀及相應(yīng)試劑測定），濃度大于15 ng/mL時(shí)為非正常升高。而實(shí)際操作中，海洛因成癮者中毒癥狀的認(rèn)定與取血時(shí)機(jī)對肥大細(xì)胞脫顆粒有一定影響，由于癥狀不夠典型或癥狀緩解后取血，都會使類胰蛋白酶及類糜蛋白酶的實(shí)測值與預(yù)期有差異。Erik等[5]在創(chuàng)傷死亡者血漿中測得類胰蛋白酶一般在10 ng/mL以上。后來的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于肥大細(xì)胞多分布于心臟及肺臟，而類胰蛋白酶、類糜蛋白酶的釋放又與組織損傷程度有關(guān)，所以兩者在復(fù)合創(chuàng)傷者中濃度要大于單純創(chuàng)傷，胸部創(chuàng)傷及擠壓損傷實(shí)測值要大于其他部位創(chuàng)傷[12]，這就造成單純顱腦損傷患者血漿中測得類胰蛋白酶-類糜蛋白酶與文獻(xiàn)記錄有一定差異。急性心肌梗死患者也存在發(fā)病程度與取血時(shí)機(jī)的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在臨床與法醫(yī)病理學(xué)檢案中，應(yīng)用類胰蛋白酶、類糜蛋白酶對過敏性休克診斷和認(rèn)定時(shí)，應(yīng)排除海洛因中毒等非變態(tài)反應(yīng)性過敏反應(yīng)以及創(chuàng)傷、急性心肌梗死等情況，如要區(qū)別上述原因以外的其他誘因是否導(dǎo)致過敏性反應(yīng)，應(yīng)結(jié)合其他指標(biāo)（如IgE、組織胺）以及臨床表現(xiàn)綜合判斷，同時(shí)，類胰蛋白酶及類糜蛋白酶的變化也為海洛因中毒者診斷拓展了新的研究方向。

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M easurment of tryptase and chymase p lasm contents of heroin intoxation person

WUWenjie1,2GUOXiangjie1GUOHongmin2YANGKai1GAOCairong1
1.Department of Forensic Medicine,Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China;2.Yingze Station of Taiyuan Public Security Bureau,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China

Objective To approach the change of plasma trypatase and chymase contents and itsmechanisms of heroin intoxation persons stand with non-allergia anaphylaxis.Methods22 cases of normal people were divided into control group;19 cases of heroin intoxation person were divided into experimental group 1;20 cases of brain injury patientswere divided into experimental group 2;22 cases of patientswho were attacked acutemyocardial infarction firstly were divided into experimental group 3.The level of plasma tryptase and chymase weremeasured in all groups by ELISA.Result s The plasma tryptase and chymase levels of the control group were differences between the three experimental groups (P＜0.05),the plasms tryptase and chymase levels of the experimental group were higher than those of the control group;but there were no statistic significance between any two groups of the three experimental groups(P＞0.05).ConclusionThe tryptase and chymase level of heroin intoxation person,brain injury patients and myocardial infarction patientswere all increased.It indicates that there aremast cell degranulation or lysis in the non-allergia anaphylaxis and other two diseases.The higher level of tryptase and chymase in plasm is one of the diagnostic criteria in diagnosis of the non-allergia anaphylaxis,which should get rid of acutemyocardial infarction and brain injury,or combined with other index for synthetic judgment.

Tryptase;Chymase;Heroin intoxation;Craniocerebral injury;Acutemyocardial infarction

R595.4

A

1673-7210（2012）05（a）-0089-03

山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2009-51）；山西省國際科技合作項(xiàng)目（2010081063）。

武文杰（1982-），男，山西太原人，2009級法醫(yī)病理學(xué)在讀碩士研究生，主要從事臨床醫(yī)學(xué)及法醫(yī)病理學(xué)工作。

高彩榮（1960-），女，漢族，山西夏縣人，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)的教學(xué)、研究和檢案工作。

2012-02-10 本文編輯：程 銘）