凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜法測定油脂及油炸食品中的酚類抗氧化劑

申世剛，宋煒，沙潤甲，李揮,，張敬軒

(1.河北大學 化學與環境科學學院，教育部藥物化學與分子診斷重點實驗室，河北 保定 071002；2.河北省食品質量監督檢驗研究院，河北 石家莊 050051)

凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜法測定油脂及油炸食品中的酚類抗氧化劑

申世剛1，宋煒1，沙潤甲1，李揮1,2，張敬軒2

(1.河北大學 化學與環境科學學院，教育部藥物化學與分子診斷重點實驗室，河北 保定 071002；2.河北省食品質量監督檢驗研究院，河北 石家莊 050051)

建立了使用凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜(GPC-SPE-HPLC)測定油脂及油炸食品中的4種常見酚類抗氧化劑沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)的方法.試樣經乙酸乙酯-環己烷(V(乙酸乙酯)∶V(環已烷)=1∶1)和乙腈漩渦振蕩萃取，凝膠滲透色譜(GPC)和HLB固相萃取柱凈化，以乙腈-體積分數為0.1%甲酸水溶液為流動相，以BDS HYPERSIL C18柱作為分離柱，在檢測波長280 nm下用紫外檢測器檢測.方法的檢出限為0.6～1.0 mg/kg(油脂樣品)和0.3～0.5 mg/kg(油炸樣品)，定量限為2～3 mg/kg(油脂樣品)和1～1.7 mg/kg(油炸樣品)，線性相關系數rgt;0.998，平均回收率為80.3%～94.0%(油脂樣品)和80.3%～93.4%(油炸樣品)；相對標準偏差(RSD)為3.22%～8.80%(油脂樣品)和2.74%～9.62%(油炸樣品).該方法選擇性好，靈敏度高，檢出限低，能夠成功地應用于油脂及油炸食品中4種常見酚類抗氧化劑的檢測.

凝膠滲透色譜；固相萃取柱；高效液相色譜；酚類抗氧化劑；油脂及油炸食品

油脂及油炸食品中常需要添加抗氧化劑來延長油品氧化反應的誘導期，減緩油品氧化速度，以達到延長油品的使用壽命.最常添加的抗氧化劑有沒食子酸丙酯(propyl gallate，PG)、叔丁基對苯二酚(tertiary butyl-hydroquinone，TBHQ)、叔丁基對羥基茴香醚(butylated hyd-roxylanisole，BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hyd-roxytoluene，BHT)等酚類抗氧化劑，這些抗氧化劑可以單獨使用，也可以混合使用.由于長期過量食用含抗氧化劑的食品,對人體健康有不利影響.因此很多國家對食用抗氧化劑都有嚴格的使用限量[1]，并且有些抗氧化劑在一些國家已禁止使用.

目前，常用于油脂及油炸食品中酚類抗氧化劑的測定方法有液相色譜法[2-7]、氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質譜法[10-12]、液相色譜-質譜法[13]等.這些方法中，對樣品的前處理大多采用液-液提取方式，但是其對脂溶性抗氧化劑的提取效率較低、脂肪基質很難凈化完全，選擇性不好、靈敏度不高、準確度低，當樣品成分比較復雜時，雜質干擾可能嚴重影響檢測結果，從而無法滿足含抗氧化劑食品的市場監管和進出口貿易要求.實驗采用漩渦振蕩萃取，凝膠滲透色譜(GPC)和HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜(HPLC)測定油脂及油炸食品中4種酚類抗氧化劑.本方法選擇性好，靈敏度高，自動化水平高.能準確、快速地測定油脂及油炸食品中的4種酚類抗氧化劑.

1 實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；J2凝膠色譜凈化系統(美國J2公司)；固相萃取裝置(美國Agilent公司)；Oasis HLB固相萃取柱(1 g，6 mL，美國Waters公司)；氮吹儀；KQ-250DV型數控超聲波清洗器；PG，TBHQ，BHA，BHT標準品；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環己烷為色譜純；其他試劑均為分析純.

精確稱取各抗氧化劑標準品0.100 g，用甲醇溶解定容至100 mL，制得標準儲備液(1.00 mg/mL)，置于冰箱中冷藏保存.使用時根據實驗要求，再用乙腈稀釋成適當濃度的標準品混合工作溶液，冷藏保存.

1.2樣品前處理

油脂樣品：準確稱取1.0 g試樣于GPC管中，加入乙酸乙酯-環己烷(V(乙酸乙酯)∶V(環已烷)=1∶1)至10 mL，渦旋振蕩提取2 min，過GPC凈化，收集7.0～13.5 min的餾分，40 ℃下氮氣吹干，殘渣中加入乙酸乙酯-環己烷至10 mL，渦旋振蕩提取2 min，經過GPC進行二次凈化，將餾分在40 ℃下氮氣吹干，加體積分數為50%甲醇-水定容至2 mL，過HLB固相萃取柱(事先依次用3 mL甲醇，3 mL水活化柱子)并收集濾液，用4 mL甲醇洗脫，收集約6 mL的洗脫液，40 ℃下氮氣吹干，加乙腈定容至1.0 mL, 渦旋混勻，15 000 r/min離心1 min，用0.22 μm濾膜過濾后, 供 HPLC測定.

油炸食品：稱取(2.0±0.05)g 粉碎均勻的樣品于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈，旋渦振蕩混勻1 min,室溫下超聲提取15 min.取出離心管，15 000 r/min離心3 min, 將上清液轉移至另一50 mL離心管中，用5 mL乙腈重復提取1次，合并2次上清液于40 ℃下氮氣吹干，加入乙酸乙酯-環己烷至10 mL，以下步驟同油脂樣品的測定.

1.3 GPC條件

GPC條件：CO785凝膠凈化柱(美國J2公司)，填料為Boi Beads S-X3(200～400目)；流動相為乙酸乙酯-環己烷；流量4.7 mL/min；進樣量5 mL；檢測波長254 nm；樣品收集時間7.0～13.5 min.

1.4液相色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱(100 mm×4.6 mm×2.4 μm)；流動相：A(體積分數為0.1%甲酸水溶液)-B(乙腈)；梯度洗脫：0～2 min, 45%B；2～5 min, 45%～70%B；5～6 min, 70%～95%B；6～18 min, 95%～100%B；后運行時間：5 min；流速：0.3 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃.

2 結果與討論

2.1樣品前處理條件的選擇及優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

分別采用甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯-環己烷(V(乙酸乙酯)∶V(環已烷)=1∶1)作為提取溶劑對同一油炸食品進行提取,對比并考察了不同提取試劑對4種抗氧化劑的回收率.結果表明，乙酸乙酯-環己烷的提取效率最低.乙醇和甲醇的沸點相對較高濃縮費時，且提取的雜質太多,提取效率低，不利于后續GPC和SPE凈化，影響最終結果的準確性.采用乙腈作為提取溶劑時,雜質含量相對較低，提取效率高，準確性高，因此選用乙腈作為提取溶劑.比較了不同的萃取時間(10,15,20 min)，萃取體積(5,10,15,20 mL)和萃取次數(1,2,3次)對回收率的影響，結果發現，先用15 mL乙腈超聲15 min萃取第1次，后用5 mL乙腈重復萃取第2次，平均回收率可達到90%以上.

2.1.2 GPC和SPE凈化條件的選擇

相對于單一的液-液萃取方式而言，凝膠滲透色譜不但能有效地去除油脂、天然色素等高分子質量的干擾物，而且可用于小分子物質的分離和鑒定，以及分析化學性質相同分子體積不同的高分子同系物.在流速為4.7 mL/min條件下，向空白油脂基質中添加10 mg/kg的抗氧化劑混合標準溶液，按照1.3條件進行凈化，如圖1.為了確定4種抗氧化劑在GPC上的收集時間，用1 μg/mL的抗氧化劑混合標準溶液按上述條件進行凈化，如圖2.從圖2可知，4種抗氧化劑的流出時間集中在7.0～11.0 min.考慮到收集的完全性，用5 μg/mL的抗氧化劑混合標準溶液按上述條件進行凈化，分別收集6.5～11.0 min，6.5～11.5 min, 7.0～11.0 min, 7.0～11.5 min, 7.0～12.5 min及7.0～13.5 min的餾分進行測定，結果表明，收集時間段為7.0～13.5 min時4種抗氧化劑的回收率均達到90%以上.用10 μg/mL的混合標準溶液按上述條件分別進行GPC一次凈化和GPC二次凈化，收集7.0～13.5 min的餾分，測定一次凈化和二次凈化時的回收率，結果表明，一次凈化和二次凈化時4種抗氧化劑的平均回收率分別為87.6%和92.0%.因此，最終確定收集時間段為7.0～13.5 min，用GPC進行二次凈化時4種目標物質的回收率最高.

圖1 油脂和抗氧化劑的GPC色譜 圖2 抗氧化劑的GPC色譜

為使目標化合物得到進一步的分離和富集，比較了在油脂和油炸食品2種空白基質中分別添加濃度為50 mg/kg和25 mg/kg的混合標準溶液，平行固相萃取3次，比較了3種固相萃取柱(硅膠、C18柱和HLB柱)的凈化效果.結果表明，油脂加標的平均回收率分別為82.3%(硅膠)、86.7%(C18柱)和90.3%(HLB柱)，油炸食品加標的平均回收率分別為80.5%(硅膠)、84.4%(C18柱)和91.6%(HLB柱).通過比較不同的洗脫試劑(甲醇、乙腈)、洗脫試劑的體積(3，4，和5 mL)對回收率的影響，最終確定使用HLB柱凈化，4 mL的甲醇洗脫時效果最好.

2.2色譜條件的選擇

實驗優選梯度洗脫，對比了不同流動相的配比，進一步優化柱溫、進樣量和流速等條件，使4種色譜峰能夠完全分開，峰形尖銳，無峰拖尾現象，相應值高，樣品測定可在18 min內完成.見圖3，圖4.

1.PG; 2.TBHQ; 3.BHA ;4.BHT. 1.PG; 2.TBHQ; 3.BHA; 4.BHT.

2.3方法的線性方程和檢出限

取4 種酚類抗氧化劑的標準儲備液，用乙腈作為稀釋液 ，配制成6種不同質量濃度(1,5,10,20,50,100 μg/mL)的混合標準工作溶液，按照2.5色譜條件進行測定，以混合標準溶液的濃度為橫坐標(x)、色譜峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線,并采用向空白組織中添加目標化合物的方法, 依據色譜峰信噪比S/N gt; 3 計算方法檢出限,S/N gt; 10計算方法定量限(表1).結果顯示，4種抗氧化劑在5～100 μg/mL其線性關系良好，相關系數均大于0.998，其檢出限(LOD)分別為 0.6～1.0 mg/kg(油脂樣品)和0.3～0.5 mg/kg(油炸樣品)，定量限(LOQ)為2～3 mg/kg(油脂樣品)和1～1.7 mg/kg(油炸樣品).

表1 線性方程、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.4方法的回收率和精密度

向2種空白基質中分別添加20,40,60 mg/kg(油脂樣品)和10,20,30 mg/kg(油炸樣品)3個添加水平的混合標準溶液，每種質量濃度平行測定6次(表2).結果表明，上述4種抗氧化劑的平均回收率為80.3%～94.0%(油脂樣品)和80.3%～93.4%(油炸樣品)，相對標準偏差為3.22%～8.80%(油脂樣品)和2.74%～9.62%(油炸樣品)，方法定性、定量準確.

2.5實際樣品分析

實驗測定了不同油脂(花生油、玉米油、大豆油、色拉油)和油炸食品(江米條、方便面、油炸薯片、油炸花生、怪味胡豆)中的4種常見酚類抗氧化劑的含量.結果發現，玉米油和色拉油中含有BHT，含量分別為5.69 mg/kg和7.82 mg/kg，油炸花生和怪味胡豆中均含有TBHQ，含量分別為34.2 mg/kg和27.5 mg/kg，其含量均低于GB 2760-2007制定的食品中抗氧化劑的最高殘留限量40 mg/kg(BHT，BHA，TBHQ)和10 mg/kg(PG).

表2 加標油脂和油炸樣品的測定

3 結論

建立的GPC-SPE-HPLC法可同時測定油脂及油炸食品中4種酚類抗氧化劑.具有樣品檢測限低、靈敏度高、選擇性好和自動化水平較高等特點，為今后對這4種酚類抗氧化劑的檢測提供了一種有效方法，可保證油脂及油炸食品中4種酚類抗氧化劑的定性和定量分析.

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(責任編輯：梁俊紅)

DeterminationofphenolicantioxidantsinoilandfriedfoodsbyGPC-SPE-HPLC

SHENShi-gang1,SONGWei1，SHARun-jia1,LIHui1,2,ZHANGJing-xuan2

(1.College of Chemistry and Environmental Science, Key Laboratory of Medical Chemistry and Molecular Diagnosis, Hebei University, Baoding 071002，China；2.Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051,China)

A method has been developed for the determination of four phenolic antioxidants, namely propyl gallate(PG),tertiary butylhydroquinone(TBHQ), butylated hydroxyanisole (BHA) and butylated hydroxytoluene (BHT) in oil and fried foods by gel permeation chromatography’solid phase extraction-high performance liquid chromatograph(GPC-SPE-HPLC).The sample was extracted with cyclohexane/ethyl acetate mixture (1∶1,V/V) and acetonitrile on a vortex mixer, cleaned up through gel permeation chromatography and follow a further HLB solid phase extraction, eluted by the mobile phase of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid with BDS HYPERSIL C18 column as the separation column, the eluents were determined by HPLC at wavelength of 280nm using ultraviolet detector.The limits of detection (LOD) was 0.6-1.0 mg/kg(oil) and 0.30-0.50 mg/kg (fried foods), the limits of quantification (LOQ) was 2.0-3.0 mg/kg(oil) and 1.0-1.7 mg/kg (fried foods), the calibration curves showed good linearity with correlation coefficients larger than 0.998,the mean recoveries were in the range of 80.3%-94.0%(oil) and 80.3%-93.4%(fried foods), and accordingly the relative standard deviation ranged from 3.22%-8.80%(oil) and 2.74%-9.62% (fried foods).The method is of high sensitivity, low detection limit, good determination, and can be used to accurately determine four phenolic antioxidants in oil and fried foods.

GPC; SPE; HPLC; phenolic antioxidants; oil and fried foods

O657.7

A

1000-1565(2012)01-0042-05

2011-10-15

河北省平臺建設與基礎研究重點計劃項目(09965120D)

申世剛(1964-),男,河北阜城人，河北大學教授,主要從事食品安全、化學反應動力學方向研究.

E-mail:Shenrq@yahoo.com.cn