楊 虹，彭 芳，劉 杰，吳 芹，時京珍

(貴陽中醫學院1.實驗中心基礎醫學實驗室，2.生理教研室，貴州貴陽 550002;3.遵義醫學院藥理研究室貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州遵義 563003)

朱砂為硫化物類辰砂族礦石辰砂，主要成分為硫化汞(HgS)，尚含有少量可溶性汞，具有清心鎮驚以及安神等功效，為中醫臨床常用，2005版《中國藥典》收載的564種中成藥中，含朱砂制劑約占總數的7.6%。然而因朱砂中含重金屬汞，各國藥品標準均以總汞含量衡量其毒性，致使朱砂及其復方汞含量超標的問題嚴重。汞在自然界中有多種存在形式，其吸收分布均有很大的差異，將汞的毒性等同于朱砂的毒性，以總汞含量評價朱砂及其復方的毒性是否合理?肝是藥物代謝的主要臟器，也是汞的毒性靶器官之一。本文采用短期給藥臨床劑量，探討朱砂及其復方朱砂安神丸、對比 HgS和氯化汞(HgCl2)對大鼠肝及對金屬硫蛋白、細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)、結構型雄烷受體(constitutive and rostane receptor，CAR)等基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD大鼠，雄性，體質量200～226 g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號:SCXK(渝)2007-0008。

1.2 藥品與試劑

朱砂(亳州市京晥中藥飲片廠，水飛炮制品)、HgCl2(貴州省萬山特區礦產公司)、朱砂安神丸水蜜丸(哈藥集團世一堂制藥廠)、HgS(美國Sigma公司)、Trizol和RNA純化試劑盒(北京Tiangen)、High capacity RT試劑盒和POWER SYBR?GREEN PCRMaster Mix(美國ABI公司)、引物設計與合成(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器

F732-V型冷原子吸收測汞儀(上海華光儀器儀表廠)，RealTime-PCR(美國 Bio-Rad 公司)，TU-1810紫外-可見分光光度計 (北京通用分析儀器公司)。Master Cycler Gradient PCR儀(德國eppendorf公司)。

1.4 動物分組給藥

健康雄性SD大鼠30只，隨機分為5組，正常對照組、HgS組、朱砂組、朱砂安神丸組和HgCl2組，每組6只。按照分組分別ig給予等量生理鹽水、HgS 0.15 g·kg－1(含汞 0.13 g·kg－1)、朱砂0.15 g·kg－1(含汞 0.13 g·kg－1)、朱砂安神丸1.4 g·kg－1(含汞0.13 g·kg－1，為臨床 0.2 g·kg－1等效劑量)、HgCl20.02 g·kg－1(含汞 0.015 g·kg－1)，每天 1 次，連續21 d，斷頭取血，取肝組織。

1.5 大鼠一般情況觀察和體質量測定

給藥期間觀察大鼠精神狀態、毛發質量、活動情況和進食情況。于給藥第1，6，13和21天稱取大鼠體質量，繪制體質量變化曲線。

1.6 肝指數的測定

取肝稱濕重，計算肝指數。肝指數=肝質量(mg)/體質量(g)。

1.7 血清谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)的檢測

斷頭取大鼠血，以900×g，4℃離心10 min后吸取血清，全自動生化分析儀測定ALT含量。

1.8 大鼠肝汞蓄積量的檢測

冷原子吸收光譜法檢測大鼠肝組織中汞蓄積量。繪制標準曲線:汞40 μg·L－1標準液，依次吸取0，2，4，6，8 和10 ml至反應瓶中，定容至25 ml，分別加入氯化亞錫100 g·L－1溶液2 ml，迅速蓋緊瓶塞記錄反應峰值，根據結果制作標準曲線。取一定量大鼠肝組織放入消化罐中，加入濃 HNO35 ml，170℃消化2 h后將消化液定容至25 ml。分別加入氯化亞錫100 g·L－1溶液2 ml，迅速蓋緊記錄峰值，根據結果計算大鼠肝中的汞蓄積量。

1.9 實時RT-PCR方法測定基因表達

取50～100 mg肝組織，采用Trizol一步法提取總RNA，按照RNA純化試劑盒說明純化，得100 μl RNA純化液。紫外分光光度計檢測RNA純度，配置 2000 mg·L－1的 RNA 樣品稀釋液 50 μl。取 5 μl RNA稀釋液按High Capacity RT試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，稀釋成100 mg·L－1備用。引物序列見表1。逆轉錄條件:25℃ ×10 min，37℃ ×2 h，85℃ ×5 min，4℃后取出。PCR 擴增:配置 15 μl反應體系，包 括 3 μl cDNA 稀 釋 液，7.5 μl POWER SYBR?GREEN PCRMaster Mix，混合引物(表1)0.5 μl，DEPC 水 4 μl。反應條件:95℃ × 10 min，3個循環;95℃ ×10 s，60℃ ×1 min，40 個循環;95℃ ×1 min，55℃ ×1 min;55℃ ×10 s，80 個循環。根據結果對基因表達進行相對定量。基因相對表達(%)=目的基因的表達/內參基因的表達×100%。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠日常行為的影響

與正常對照組相比，給藥初期，HgCl2組大鼠進食明顯減少，不喜活動。給藥中后期，精神較差，毛質粗糙微泛黃，毛發排列混亂不服貼，喂藥反抗明顯。其他組大鼠精神狀態良好，飲食活動等無明顯差異。

2.2 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠體質量的影響

大鼠體質量變化見圖1。汞含量約為朱砂安神丸汞含量1/10的HgCl2，給藥后立即出現體質量負增長，第6天體質量緩慢增長。與正常對照組相比，HgCl2組大鼠第6，13，21天體質量均明顯降低(P＜0.05);但HgS、朱砂和朱砂安神丸組大鼠第6，13，21天體質量與對照組沒有顯著差異。

Tab.1 Sequences of the primers

Fig.1 Effect of different mercury compounds on body mass of rats.Thirty male SD rats were orally gavaged normal saline，HgS 0.15 g·kg－1，cinnabar 0.15 g·kg－1，Zhusha Anshenwan 1.4 g·kg－1and HgCl20.02 g·kg－1，once daily，for 21 d.Animal body mass gain was calculated at the beginning，on the sixth，the thirteenth，and twenty first day.±s，n=6.*P＜0.05，compared with corresponding normal control group.

2.3 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝指數和血清谷丙轉氨酶的影響

如表2所示，與正常對照組相比，HgS，朱砂和朱砂安神丸和HgCl2組大鼠肝指數和ALT含量均無統計學差異，但HgCl2組大鼠肝指數有所升高。

Tab.2 Effect of mercury compounds on liver index and serum alanine transaminase(ALT)activity in rats

2.4 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織中汞蓄積量的影響

如圖2所示，與正常對照組相比，HgCl2組大鼠組織汞蓄積量明顯升高(P＜0.05)，而HgS、朱砂和朱砂安神丸組無明顯差異。

2.5 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織基因表達的影響

2.5.1 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織MT-2 mRNA表達的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，HgCl2組大鼠肝組織MT-2基因相對表達量明顯增高(P＜0.05)，表明HgCl2可明顯上調MT-2基因的表達，而其他組沒有明顯的統計學差異。

Fig.2 Hg contents in the livers of different mercury compounds-treated rats.See Fig.1 for animal treatment.Livers were colffected at the end of experiment and Hg contents were determined by the cold atomic absorption spectrometry.1.Normal control;2.HgS;3.cinnabar;4.Zhusha Anshenwan;5.HgCl2.±s，n=6.*P＜0.05，compared with normal control group.

Fig.3 Effect of different mercury compounds on expressions of MT-2 mRNA in the livers.See Fig.1 for animal treatment.MT-2 relative expression(%)=MT-2 gene expression/β-actin gene expression×100%.1:normal control;2:HgS;3:cinnabar;4:Zhusha Anshenwan;5:HgCl2.±s，n=6.*P＜0.05，compared with normal control group.

2.5.2 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織CYP1A1，CYP1A2，CYP3A2和CYP4A10基因表達的影響

由表3可見，與正常對照組相比，HgCl2組大鼠CYP1A1和CYP1A2基因表達明顯增高(P＜0.05)，CYP4A10基因表達有增高趨勢但沒有統計學意義。朱砂組CYP3A2基因表達明顯升高(P＜0.05)，而HgS組、朱砂安神丸組沒有統計學差異。

2.5.3 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織CAR及CYP2B1基因表達的影響

由表4可見，與正常對照組相比，HgCl2組CAR基因表達明顯降低(P＜0.05)，其他組沒有統計學差異。CYP2B1基因表達各組之間沒有統計學差異。

Tab.3 Effect of different mercury compounds on mRNA expressions of CYP1A1，CYP1A2，CYP3A2 and CYP4A10

Tab.4 Effect of different mercury compounds on mRNA expressions of CAR and CYP2B1 in livers of rats

3 討論

朱砂安神丸出自李東垣名作《內外傷辨惑論》一書，以朱砂為君，黃連為臣，生地、當歸為佐，甘草為使，可清心養血，鎮驚安神，為我國中醫臨床常用，然而其全方含汞約9%[1]，臨床使用是否安全遭到質疑。HgS是朱砂中的主要成分，2010藥典規定炮制朱砂的HgS含量不得低于98%，其在水中的解離度極小(溶度積為 Ksp=10－52)，口服吸收率僅為0.2%。HgS是否為朱砂及其復方朱砂安神丸產生藥理、毒理作用的物質基礎，目前尚無定論[2]。本實驗研究表明，短期以臨床劑量給予朱砂安神丸，相同汞含量的情況下比較HgS、朱砂、朱砂安神丸三者的毒性，三組大鼠體征沒有明顯改變，肝汞蓄積量，肝指數、生化指標檢測均與正常組沒有明顯差異。HgCl2為可溶性二價汞，其在體內的吸收率為7%～15%，遠高于HgS。本實驗結果顯示，給予HgCl20.02 g·kg－1(含汞0.015 g·kg－1，約 1/10 朱砂中汞含量)，其在肝組織內的汞蓄積量明顯高于其他各組，肝較其他各組有增大趨勢。HgCl2組在給藥初期體質量明顯降低，給藥中后期體質量增加緩慢，提示持續給藥后體內的解毒機制可能發揮了作用，但隨著給藥時間延長，機體對HgCl2出現不能耐受的趨勢。

MT富含巰基，可大量結合金屬，并可被金屬誘導合成增加，具有抗氧化損傷、重金屬解毒等作用[3]。在本實驗中，HgCl2組大鼠肝組織MT-2基因表達顯著增高，可明顯上調MT-2基因的表達。而HgS、朱砂、朱砂安神丸組與正常組的MT-2基因表達沒有明顯差異，均未觸發MT-2基因表達。

CYP酶系是參與體內藥物代謝的主要酶系，CYP1A1，CYP1A2均可激活前致癌物導致癌癥的發生[4]。同時，重金屬可誘導 CYP1A1 的表達[5]，在亞慢性小鼠汞暴露實驗中，甲基汞2.6 mg·kg－1可誘導CYP1A1基因表達上調[6]。本實驗中HgCl2組已明顯誘導CYP1A1，CYP1A2基因表達的增高，而HgS、朱砂和朱砂安神丸組與正常對照組的CYP1A1，CYP1A2基因表達沒有明顯差異。

CYP3A2是大鼠體內重要的CYP3A亞型，臨床上有超過60%的藥物通過CYP3A代謝，是參與首過效應的重要代謝酶。本實驗中朱砂組明顯上調了CYP3A2的基因表達，HgS、朱砂安神丸、HgCl2組則與正常組沒有顯著差異，在何海洋等[7]小鼠急性毒性實驗、陸遠富等[6]亞慢性小鼠毒性實驗中，朱砂300 mg·kg－1均明顯上調小鼠 CYP3A11 mRNA 表達，提示朱砂在與其他藥物聯用時可能影響其首過消除。

CYP4A10是人類CYP4A11的異體同工酶，該基因對肝毒物敏感[8]，易被肝致癌物誘導。同時，CYP4A10表達上調可導致肝內氧應激和脂質過氧化作用增強，誘發炎癥反應而發生非酒精性脂肪肝[9]。本實驗中HgCl2組CYP4A10表達雖與正常組無統計學意義，但有增高趨勢，而其他各組并未發現這個誘發趨勢。

結構型雄烷受體CAR是核受體超家族的重要成員，主要存在于肝，參與調節多種藥物代謝酶，與外源性物質代謝以及肝疾病的發生發展密切相關[10]。CAR可參與疏水性膽汁酸石膽酸的解毒過程，CAR的表達缺失可能導致膽汁淤積和肝損傷[11];CAR可以調節幾乎所有膽紅素轉運轉化排泄的相關代謝酶和轉運體，CAR表達抑制可引起膽紅素聚集，引發高膽紅素血癥而產生黃疸[12]。本實驗中HgCl2組明顯降低了CAR基因表達，而其他各組與正常組沒有統計學差異。

大鼠CYP2B1受CAR通路調節，在小鼠體內的同工酶為CYP2B9，人體內為CYP2B6。參與多種毒物代謝及大約7%的常用藥物代謝[13]。本實驗中，HgCl2組CAR基因表達下調，但各組CYP2B1基因表達沒有統計學差異。在何海洋等[7]小鼠急性汞暴露實驗中，朱砂安神丸10 g·kg－1、朱砂 0.3 g·kg－1下調了小鼠 CYP2B9基因，而在陸遠富等[6]朱砂300 mg·kg－1和 HgCl232 mg·kg－1連續給藥 44 d 實驗中，小鼠CYP2B9基因則被誘導表達增高。以上實驗結果提示，大鼠CYP2B1基因與小鼠CYP2B9基因可能具有種屬差異性，同時其表達與給藥劑量和給藥時間有關。

課題組前期通過急性毒性實驗和亞慢性毒性實驗結果表明，朱砂及其復方朱砂安神丸未對肝造成明顯損傷，其毒性與HgCl2、甲基汞等汞存在形式相差甚遠[14－17]。本研究結果中 MT-2，P450 酶、核受體CAR在基因水平發生的變化是否會導致相應酶活性的改變以及蛋白質含量上的變化，這些還有待進一步的研究。

綜上所述，HgCl2在肝內大量蓄積，機體可通過調動相關解毒蛋白如MT減輕HgCl2對肝組織的傷害。HgCl2可明顯改變P450酶基因的表達，下調CAR基因的表達。而HgS、朱砂、朱砂安神丸尚未明顯改變上述基因的表達，但朱砂可能影響其他肝代謝藥物的首過效應。

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