HSP基因診斷平臺的建立和新的HSP致病基因定位的初步研究

葉劍榮 袁利群 龍湘黨 諶兵來

1.湖南省人民醫院檢驗科，湖南長沙 410005；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 201203

HSP基因診斷平臺的建立和新的HSP致病基因定位的初步研究

葉劍榮1袁利群1龍湘黨1諶兵來2

1.湖南省人民醫院檢驗科，湖南長沙 410005；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 201203

目的探討我國各地HSP家系先證者及成員的基本情況，并定位新的HSP致病基因以便于為我國HSP基因診斷平臺的建立提供依據。方法收集我國遺傳病資源管理中心的80例HSP家系先證者和成員為研究對象，抽取靜脈抗凝血液實施基因提取并進行研究。結果HSP患者中男性比例較高，單純型HSP患者比例較高，首發癥狀中以下肢肌張力升高所占比例最高，為100%，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。單純型HSP患者的基因SPG4、SPG3A突變頻率明顯高于復雜型，SPG6突變頻率明顯低于復雜型，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。對患者致病基因相關單核苷酸多態性（SNP）位點LOD值比較，結果輸入UCSC數據庫進行分析，結果顯示相應區間屬于19號染色體，位于著絲點附近。結論SPG4、SPG3A在臨床診斷單純型HSP患者具有較好的指示作用，SPG6在診斷復雜型HSP患者時具有較好的指示作用；新的HSP致病基因亞型在19號染色體著絲粒附近的P12-Q12區域。

HSP基因；診斷平臺；致病基因定位；初步研究

HSP又名家族性Strumpell-Lorrain痙攣性截癱[1]，屬于因皮質脊髓束損傷而造成的具有遺傳異質性的神經退行性疾病，患者臨床表現為下肢肌張力升高、脊柱側彎、腱反射亢進、進行性痙攣步態、髕踝陣攣等，一些患者可能還伴智力障礙、視神經萎縮、白內障、小腦性共濟失調、神經性耳聾、錐體外系癥狀、腦白質病變、腦萎縮等其他類型神經系統癥狀[2-3]，不僅影響患者自身的日常生活和自理，同時影響家庭生活與和諧，增加生活負擔。本研究選取2010年4月～2012年3月間我國各地HSP家系先證者和成員進行相關研究，探討我國各地HSP家系先證者及成員的基本情況，并定位新的HSP致病基因以便于為我國HSP基因診斷平臺的建立提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我國遺傳病資源管理中心的80例HSP家系先證者和成員為研究對象，其中男55例，女25例；年齡12～44歲，平均（25.8±2.3）歲；病程2～28年，平均（15.8±8.2）年；籍貫包括吉林、山東、河北、湖北、湖南、江蘇、江西、廣東等。另選取健康人群100例作為對照，其中男68例，女32例，年齡10～47歲，平均（26.6±3.5）歲；健康受試者性別、年齡、籍貫與HSP家系先證者和成員差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有受試者均經由甲狀腺、腎上腺、肝腎功能檢測，并行血清B12檢測、CT或MRI掃描，患者均無原發性側索硬化、多發性硬化、中樞神經系統異常、腎上腺腦白質營養不良和B12缺乏等。所有患者及受試家系成員均知情并簽署同意書。

1.2 方法

所有受試HSP家系先證者和成員均抽取靜脈抗凝血液5～10mL，并應用酚/氯仿法提取DNA。采用加拿大提供的Primer3.0進行引物設計，完成對序列的設計。進行PCR反應和擴增產物檢測，電泳后行固定、染色和顯色。獲得所需大小的片段后，以核酸外切酶和蝦堿性磷酸酶將片段置于冰上處理，試劑包括：SAP 0.8μL，ddH2O 0.75μL，ExonucleaseⅠ0.25μL，SAPbuffer 0.2μL和PCR片段8μL。經室溫孵育90 min后，于80℃環境下滅活核酸外切酶和蝦堿性磷酸酶15min，采用ABIprism3730儀器進行測序，再應用Dnastar軟件進行序列分析。分別通過單核苷酸多態性（SNP）國際聯合會（TSC）、美國國立生物技術信息中心（NCBI）、人類基因突變數據庫查詢以排除堿基序列變異中已知的基因多態，將剩余未知基因進行疾病表型分離，再與同時檢測的100例健康人的基因進行相同位點的堿基比照，獲得基因的致病突變。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HSP家系先證者和成員基本資料比較

HSP患者中男性比例較高，單純型HSP患者比例較高，首發癥狀中以下肢肌張力升高所占比例最高，為100.00%，其次是下肢腱反射亢進，組內比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 HSP家系先證者和成員基本資料比較

2.2 不同HSP分型患者基因突變頻率比較

單純型HSP患者的基因SPG4、SPG3A突變頻率明顯高于復雜型，SPG6突變頻率明顯低于復雜型，數據經統計學比較具有顯著差異（P＜0.05）。見表2。

表2 不同HSP分型患者基因突變頻率比較[n（%）]

2.3 HSP患者致病基因和相關SNP位點LOD值比較

對患者致病基因相關SNP位點LOD值比較結果輸入UCSC數據庫進行分析，結果顯示相應區間屬于19號染色體，位于著絲點附近。見表3。

表3 HSP患者致病基因和相關核苷酸多態性位點的LOD值比較

3 討論

隨著醫學水平的提高，分子遺傳學獲得了長足的發展，目前部分HSP致病基因已經實現克隆，給臨床的相關研究提供了基于基因診斷水平的諸多依據[4]。根據患者的臨床表現，HSP可劃分為單純型病變和復雜型病變：單純型的臨床主要表現為下肢肌張力升高、脊柱側彎、腱反射亢進、進行性痙攣步態、髕踝陣攣等不良癥狀；復雜型則同時伴有其他類型神經系統的病變征狀，比如智力障礙、視神經萎縮、白內障、小腦性共濟失調、神經性耳聾、錐體外系癥狀、腦白質病變、腦萎縮等[5]。單純性患者在臨床的比例較多，在本研究中占77.5%，明顯高于復雜型（P＜0.05）。而對基因突變率研究顯示，單純型和復雜型HSP的SPG4、SPG3A、SPG6基因突變頻率明顯不同，差異有統計學意義（P＜0.05），提示SPG4、SPG3A在臨床診斷單純型HSP患者具有較好的指示作用，SPG6在診斷復雜型HSP患者時具有較好的指示作用。當然，無論是單純型還是復雜型患者SPG基因的突變都僅是一部分，相比較而言，單純型患者SPG基因突變頻率明顯高于復雜型患者（P＜0.05），提示SPG基因的相關檢測對于診斷單純型HSP患者具有更好的臨床效果，以便于為研究治療方案提供一定的依據。

對患者基因位點的研究結果顯示HSP致病基因出現在19號染色體上，且位于絲粒附近P12-Q12區域，一些外國文獻曾報道類似病例[6-7]，結果顯示患者致病基因位于19號染色體上D19S220-D19S420和D19S416-D19S220區間，屬于SPG12亞型，而本組研究結果的P12-Q12區間，不在之前的研究結果范圍之內，提示非SPG12亞型，具有特異性，可認為是新的HSP致病基因亞型，可作為建立HSP基因診斷平臺的新資源，從而擴大和完善整個診斷平臺的建設。當然，在隨后的相關工作中，還需要進一步通過對各類基因克隆策略的研究來爭取實現對HSP致病基因的克隆，從而為臨床治療提供更好的解決方案[8]。

[1]劉慶華，于軍方，梁學武，等.奶牛HSP基因多態性與血清生化指標的相關性[J].福建農林大學學報，2009，38（2）：160-163.

[2]Franca MC，Abreu A，Maurer-morelli CV，et al.Prospective neuroimaging study in hereditary spastic paraplegia with thin corpus callosum[J]. Mov Disord，2007，22（22）：1556-1558.

[3]周幫順，王茜，李海燕，等.HSP提高細菌的逆境生存能力和乙醇產量[J].生物技術，2008，18（4）：26-28.

[4]黃麟，鄭維佳，吳小芹，等.擬松材線蟲兩個HSP基因的克隆與分析[J].南京林業大學學報，2009，33（2）：1-4.

[5]湯堅，葉建仁，陳鳳毛，等.松樹體內寄生線蟲種類及其致病性[J].南京林業大學學報：自然科學版，2008，32（3）：113-116.

[6]Blair MA，Ma S，Hedera P.Mutation in KIF5A can also cause adult-onset hereditary spastic paraplegia[J].Neurogenetics，2006，7（7）：47050.

[7]Tessa A，Silvestri G，de Leva MF，et al.A novel KIF5A/SPG10 mutation in spatic paraplegia associated with axonal neuropathy[J].JNeurol，2008，255（255）：1090-1112.

[8]張祖興，李明云，陳炯，等.大黃魚熱激蛋白的基因克隆、原核表達及抗血清的制備[J].海洋與湖沼，2006，37（4）：337-339.

Prelim inary study of the establishment of HSP genes of diagnostic platform and the assignment of HSP virulence gene

YE Jianrong1 YUAN Liqun1 LONG Xiangdang1 CHEN Binglai2
1.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Hu'nan Province,Hu'nan Province,Changsha 410005,China;
2.Affiliated Shuguang Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

ObjectiveTo investigate the basic situation of the proband and members of the HSP family all over our country,and to position the new HSP genes that cause the disease to provide data for facilitating the establishment of the HSP genetic diagnostic platform.Methods80 cases of proband and members of HSP family were collected from genetic disease resourcesmanagement center,the geneswere extracted and studied from intravenous anticoagulant blood.ResultsPercentage ofmale HSP patientswas found higher,percentage of simple HSP was found higher,the highest percentage of the initial symptom was the increasing tension of lower limbmuscle,the differenceswere all statistically significant(all P＜0.05). Mutation frequencies of SPG4 and SPG3A gene in simple type genes of patientswith HSPwere found higher than those in complicated type,mutation frequency of SPG6 gene in simple type gene of patientswith HSPwas found higher than that in complicated type,the differences were all statistically significant(all P＜0.05).LOD values of related SNP points were compared in pathogenic patients,the results were entered the UCSC database for analysis,the corresponding interval was found belonged to chromosome 19 according to the results,and located near the centromere.ConclusionSPG4 and SPG3A have a better indicating effect in clinical diagnosing in simple HSP patients,SPG6 has a better indicating effect in the diagnosis of patients with complicated HSP;new HSP of subtype locate in P12-Q12 region around the centromere of chromosome 19.

HSP gene;Diagnostic platform;Causative gene positioning;Preliminary study

R744

A

1673-7210（2012）11（b）-0036-03

湖南省醫藥衛生科研計劃項目（項目編號：B2009071）。

葉劍榮（1963-），男，副主任檢驗師，主要從事免疫、基因診斷工作。

2012-06-07 本文編輯：李繼翔）