人膝骨關節炎血清生物學標志物的篩選*

曾 花， 蔡道章， 陳郁鮮， 曾 春， 葉志強， 莊 澤， 黎明濤， 胡坤華

(中山大學附屬第三醫院1急診科，2骨科，廣東廣州510630;3中山大學中山醫學院蛋白質組學研究中心，廣東廣州510080)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是由于機械和生物性因素共同作用所導致的關節軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨合成和降解動態失衡所致的全關節疾病［1］。OA以中老年患者多見，且女性多于男性，60歲以上人群患病率可達50%，75歲以上人群則達80%，該病的致殘率可高達53%，好發于負重大、活動多的關節，如膝、脊柱、髖、踝、手等關節［2］。發展到中晚期的OA往往需要手術來減輕疼痛、矯正畸形和改善關節功能，但手術不僅給患者帶來沉重的經濟負擔，也不能很好地解決關節軟骨的修復和重建問題。然而OA的發病機制目前尚不明確，缺乏有效的生物學標志物及早期診斷和治療的方法，因此采取新的方法和手段闡明OA的發病機制，發現新的疾病診斷標志物對提高OA患者的生活質量有重要意義。蛋白質組學是后基因組時代的一門新興科學，是對生物體在蛋白質水平上定量、動態、整體性的研究，同時也能為闡明眾多疾病的發病機制提供理論根據和解決途徑。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D－DIGE)聯合基質輔助激光解吸電離－飛行時間質譜(matrix－assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)，成功建立了OA血清差異蛋白質組學的研究方法，通過對篩選出的差異蛋白的進一步研究，為發現新的診斷標記物和藥物治療靶點，以及發病機制的研究提供重要線索。

材料和方法

1 材料和儀器

1．1 主要試劑 十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、過硫酸銨、丙烯酰胺、N，N'－亞甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸等均購自Sigma;去血清高峰度蛋白試劑盒ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit購自Merck;蛋白質純化試劑盒Clean－up Kit、蛋白定量試劑盒2D Quant Kit、熒光標記試劑盒CyDye DIGE Fluor Labeling Kit、固相pH值干膠條、IPG buffer等均購自 GE，α2－巨球蛋白(α2－macroglobulin，α2M;ab36995)Ⅰ抗購自Abcam，Ⅱ抗購自Jackson。

1．2 主要儀器和設備 IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳系統、Typhoon 9400型多功能激光掃描儀、DIGE分析軟件DeCyder 6．0和全自動斑點工作站Ettan Spot Handing Workstation均為GE產品，質譜儀Ultraflex III為布魯克產品;電泳凝膠成像分析系統Tanon－2500為上海天能科技有限公司產品。

2 方法

2．1 實驗對象 從中山大學附屬第三醫院骨科住院治療的30例診斷明確膝骨關節炎患者中隨機抽取4例組成本研究的OA實驗組，并根據實驗組挑選年齡、性別和體重指數(body mass index，BMI)分別對應匹配的4例健康志愿者組成本研究的對照組。本實驗標本的獲取均已征得入組人員的同意，符合相關衛生部門的倫理委員會原則。

實驗組需滿足的條件:(1)診斷明確的骨關節炎患者:臨床診斷參照2007年《骨關節炎診療指南》［2］;(2)無類風濕性關節炎等結締組織病;(3)無肝腎功能不良，免疫系統疾病;(4)抽血前1周內未曾使用過非甾體類鎮痛藥、糖皮質激素等;(5)無藥物過敏史;(6)非孕婦、哺乳期、月經期婦女;(7)既往無關節感染、結核、關節創傷手術史。對照組需滿足的條件:無包括骨關節炎在內的關節疾病的現病史和既往史。

2．2 樣品實驗前處理 所有血清樣本取清晨空腹靜脈血3 mL，室溫下靜置1 h，4℃、2 500×g離心15 min取上清，用0．2 mL EP管分裝，－80℃保存備用。集齊血清樣本后，用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit試劑盒去除高豐度蛋白，然后對樣本進行純化和定量，隨后按熒光標記試劑盒說明書對蛋白樣品進行CyDye熒光標記。2D－DIGE的實驗設計為:從正常對照組N1～N4和OA實驗組A1～A4 8個血清樣本中各取25μg蛋白共200μg進行Cy2熒光標記，作為內參照(消除膠與膠之間的差異);取N1、N2、A3、A4 4個血清樣本各50μg蛋白進行 Cy3熒光標記;取 A1、A2、N3、N4 4個血清樣本各50 μg蛋白進行Cy5熒光標記(交叉標記以消除不同熒光染色效率不同的誤差)。50μg Cy2標記的內參照、Cy3標記的N1和Cy5標記的A1混合后進行雙向電泳分離，命名為膠1;同理，內參照、N2和A2混合后為膠2，內參照、A3和N3混合后為膠3，內參照、A4和N4混合后為膠4。

2．3 2D－DIGE雙向電泳 選擇pH 4～7、24 cm的IPG膠條對血清樣品蛋白質進行第一向等電聚焦(isoelectric focusing，IEF);IEF 參數設置為:30 V、6 h;60 V、6 h;200 V、1 h;500 V、2 h;1 000 V、2 h;3 500 V、2．5 h;10 000 V、1 h;10 000 V、8 h;500 V、12 h;78 350 VHr收膠。IEF完成后，在平衡緩沖液中平衡膠條，將其轉移至12．5%SDS－PAGE膠上進行第二向電泳，電泳參數設置為:第一步蛋白轉移:2 W/gel，電泳時間 50 min;第二步垂直電泳:17 W/gel，電泳直至溴酚藍跑出凝膠下緣10 min(注:2D－DIGE凝膠的電泳在避光條件下進行)。

2．4 圖像采集與分析 用Typhoon 9400型多功能激光掃描儀凝膠蛋白圖像，使用ImageQuant軟件收集凝膠蛋白圖像，使用DeCyder 6．0軟件對凝膠蛋白圖譜進行分析，選取蛋白豐度差異＞1．2倍的蛋白質斑點、t檢驗 P＜0．05的斑點作進一步分析。

2．5 差異蛋白點質譜圖的獲取及質譜數據的分析

在Spot Handling Workstation中切取差異蛋白點，將切取的蛋白點進一步酶解，使用Bruker的Ultraflex III質譜儀對酶解樣品進行MALDI－TOF－MS分析，獲得樣品的肽質量指紋圖譜(peptide mass figerprinting，PMF)。所獲得圖譜使用Biotools軟件檢索，以Mascot(http://www．matrixscience．com)為搜索引擎在數據庫 Swiss－ Prot/Uniprot(http://www．expasy．ch/sprot/)中檢索，檢索種屬為human。

2．6 Western blotting分析 取30μg血清樣品蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE電泳)后轉印至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉該膜37℃ 1 h，沖洗后加入Ⅰ抗稀釋液(稀釋度1∶2 000)4℃孵育過夜后，再加入相應的Ⅱ抗稀釋液37℃ 孵育1 h。經ECL顯影后，用電泳凝膠成像分析系統分析灰度值。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(ˉx±s)表示，采用軟件SPSS13．0進行統計學分析，均數比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 2D－DIGE圖像采集及蛋白表達

依照2D－DIGE實驗設計，依次進行實驗樣品的CyDye熒光染色、第一向IEF電泳、第二向的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)和2D－DIGE凝膠的掃描，得到分別由Cy2、Cy3和Cy5標記的不同血清蛋白樣品的蛋白斑點圖和不同熒光疊置所得的膠內差異圖像，按實驗設計進行電泳所得的4張2DDIGE凝膠的熒光疊置圖像，各膠檢測到的蛋白斑點數分別為1567、1587、1583和1675，實驗各膠的匹配率達71%。經DeCyder軟件分析兩組間蛋白豐度差異大于1．2倍，且具有統計學意義的點共有14個，其中有9個蛋白點在OA實驗組表達上調，它們在膠上的編號為:318、536、546、757、769、773、912、916 和9175;5個蛋白點在OA實驗組表達下調，它們在膠上的編號為:657、974、1196和1221。差異蛋白點在2D－DIGE凝膠上的具體位置，見圖1。

Figure 1．The full view of protein spots．The marked spots were identified．圖1 差異蛋白點在2D－DIGE凝膠的具體位置

2 質譜鑒定聯合數據庫匹配分析結果

進行MALDI－TOF－MS鑒定的14個斑點均獲得了較好的圖譜，這些圖譜以Mascot(http://www．matrixscience．com)為搜索引擎，聯合檢索數據庫Swiss－ Prot/Uniprot(http://www．expasy．ch/sprot/)初步鑒定出OA實驗組與對照組間蛋白豐度差異大于1．2倍且有統計學意義的點共8個，其中有5個蛋白在OA組表達上調，3個蛋白在OA組表達下調，見表1。雙向電泳能根據分子量和等電點對蛋白質進行二維分離，蛋白質經過磷酸化、乙酰化、糖基化等修飾后等電點和分子量與原始狀態相比會出現偏差，在雙向電泳圖譜上表現為在不同位置出現的蛋白斑點。例如本研究中α2－macroglobulin分別在5個位置出現，inter－alpha－trypsin inhibitor heavy chain 4和kininogen－1分別在2個位置出現，但經質譜鑒定均為同一種蛋白。

表1 差異表達蛋白質譜鑒定Table 1．Results of MALDI－TOF－MSanalysis

3 Western blotting實驗結果

我們進一步采用臨床樣本進行了Western blotting驗證，結果表明，OA患者血清中α2M明顯高于正常對照，見圖2。

Figure 2．Expression ofα2 M in the sera of OA patients and the controls detected by Western blotting．N:control group;A:OA group．ˉx±s．n=15．*P＜0．05 vs control．圖2 Western blotting檢測α2 M的表達

討 論

隨著全球向老齡化社會的發展，OA已成為中老年人慢性殘障最常見的原因之一。有研究結果統計顯示，在所有導致老年殘障的疾病中，單純的膝骨關節炎的致殘率僅次于心血管疾病，處于第2位［3］，給家庭和社會帶來沉重的負擔。但對于骨關節炎的預防、早期診斷及治療目前仍缺乏高效的方法。因此，對于骨關節炎，尤其是對膝骨關節炎等大骨關節關節炎的預防、早期診斷、早期治療及發病機制的深入研究具有重大意義，關于這方面的研究也越來越受到我國乃至全球醫療機構和科研機構的重視。目前，關于OA的研究大多數以涉及OA病理改變的軟骨、滑膜為中心而展開的，實驗主要針對這些組織中的一種或幾種因素與OA的關系，而且是基于某種假定成立的預期理論進行的，這些研究的目的也是為了證實或者否定這些假定的理論。然而，蛋白質組學這一高通量、高敏感性和高精確度研究方法的出現，打破了傳統研究手段的限制，利用蛋白質組學技術可同時檢測不同樣品不同狀態下成千上萬的蛋白，這一技術的出現有利于新的蛋白生物學標志物、新藥物治療靶點及新作用機制的發現。目前，我國已有不少研究將蛋白組學的相關技術應用于各種疾病診斷及治療的研究中，如梁瓊等［4］等利用蛋白組學技術尋找骨肉瘤惡性生物學行為的分子標記物;張曉雪等［5］利用蛋白組學技術篩選類風濕關節炎患者血清特異性標志物;而胡志成等［6］則利用蛋白組學技術尋找病理性瘢痕形成機制中的特異蛋白為病理性瘢痕形成機制提供了新的思路。同時國內外也有不少研究將蛋白組學技術應用于OA的相關研究中，但大多數研究不約而同地選擇了涉及OA病理改變的軟骨、滑膜、關節液作為研究對象，多數理論也認為OA是關節軟骨的局部病變。但是，目前仍沒有任何一種關于OA的發病機制的假設理論經研究證實是一定成立的。因此，本研究突破以往研究思路的限制，選擇血清蛋白作為研究對象，期望能通過對OA血清蛋白質組學的比較分析，為OA發病機制的研究提供新的思路和實驗基礎，尋找新的OA疾病相關蛋白，篩選出能用于OA診斷、治療或發病機制研究的血清生物學標記物。

本研究采用2D－DIGE聯合MALDI－TOF－MS的比較蛋白組學研究方法，成功建立了OA患者血清雙向熒光膠內差異凝膠電泳技術體系，獲得了分離效果良好、清晰的蛋白斑點圖譜，每張膠均檢測到數以千計的蛋白點，且膠與膠之間的蛋白斑點匹配率較高，通過DeCyder軟件找到了OA患者血清中8個具有顯著差異表達的蛋白點，成功建立了OA血清差異蛋白組學的研究方法，為尋找OA血清生物標記物和OA疾病相關蛋白質的研究提供了實驗基礎。

經生物信息學檢索顯示，本研究所鑒定的在OA患者血清中差異表達的8個蛋白均直接或間接地參與機體的炎癥反應、細胞凋亡、自身免疫反應，提示骨關節炎的發病機制與機體的炎癥反應、細胞凋亡及自身免疫反應有著密切的關系。而通過對其它應用蛋白組學進行的OA相關研究的文獻與本研究比較發現，α2M極有可能為OA的早期診斷提供新的生物學標記物，為OA的早期治療提供新的藥物治療靶點，同時也為OA發病機制的研究提供了新的線索，然而其具體應用價值尚需大量的后續實驗研究工作。

α2M是由肝臟內皮細胞分泌的廣譜蛋白酶抑制劑，主要存在于血漿中，參與機體的免疫反應過程［7－8］，為 IL －1/IL －8/TNF 等炎癥因子提供結合位點，有研究表明其與阿爾茨海默病的發病有關［9－10］。

雖然骨關節炎的發病機制目前尚不明確，但大多數研究發現骨關節炎的發生主要是由軟骨細胞外基質膠原和聚集蛋白聚糖的丟失引起的［11］。軟骨聚集蛋白是由ADAMTS－4/5、ADAMTS－7/12等聚集蛋白聚糖酶降解，ADAMTS－4/5的抑制劑對軟骨蛋白聚糖的分解和代謝起調節作用，任何情況的抑制阻斷將會加速軟骨聚集蛋白聚糖的降解，之前TIMP－3是唯一一個被發現的ADAMTS－4/5內源性抑制劑，目前研究發現α2M是另一個抑制劑［12］。另有研究證明，α2M是一個新發現ADAMTS－7/12的底物，兩者結合可抑制ADAMTS－7/12對COMP的降解，同時α2M也是一種重要的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)清除劑，參與 OA的病理過程［13］。張洪等［14］通過比較兔膝骨關節炎軟骨與正常兔膝軟骨，發現軟骨細胞中α2M的表達在兔膝骨關節炎模型組陽性率均高于對照組，同時實驗組軟骨細胞凋亡的程度與α2M的表達呈負相關，表明α2M與骨關節發生發展有密切關系。林子洪等［15］通過對創傷性兔膝骨關節炎模型采用α2M關節內注射與陰性對照比較，發現α2M治療組的半月板退變速度稍慢，半月板纖維和細胞情況較好，其對關節炎癥有直接的抑制作用，但對滑膜炎癥的抑制作用較弱，提示α2M可能適合OA發病初期的保護性治療和研究。而李蔚勃等［16］通過文獻研究分析總結α2M對骨關節炎的影響可能是通過抑制MMP參與自由基的清除，通過轉運細胞因子調節MMP1的合成與代謝參與免疫過程，但其具體機制尚待進一步研究。

本實驗OA組血清α2M的升高，可能是由于OA機體自身對抗疾病的一個保護性機制導致其分泌增多，而其是否與關節軟骨局部的表達水平一致，以及與OA發病機制的具體關系尚待進一步研究。

［1］ 朱振安．重視膝關節骨關節炎的早期防治［J］．中國骨傷，2010，23(12):887 －889．

［2］ 中華醫學會骨科分會．骨關節炎診治指南(2007年版)［J］．中華關節外科雜志，2007，27(10):793 －796．

［3］ Guccione AA，Felson DT，Anderson JJ，et al．The effects of specific medical conditions on the functional limitations of elders in the framingham study ［J］．Am J Public Health，1994，84(3):351 －358．

［4］ 梁 瓊，李 揚，王連唐，等．骨肉瘤組織與良性骨腫瘤的比較蛋白質組學研究［J］．中國病理生理雜志，2009，25(6):1089 －1093．

［5］ 張曉雪，袁兆林，朱 敏，等．運用蛋白指紋圖譜技術篩選類風濕關節炎患者血清特異性標志物［J］．中國病理生理雜志，2010，26(9):1818－1823．

［6］ 胡志成，朱家源，朱 斌，等．病理性瘢痕與正常皮膚的蛋白組學研究［J］．中國病理生理雜志，2011，27(9):1802－1806．

［7］ Dodds AW，Law SK．The phylogeny and evolution of the thioester bond－containing proteins C3，C4 andα2－macroglobulin［J］．Immunol Rev，1998，166:15 －26．

［8］ Mocchegiani E，Ciavattini A，Santarelli L，et al．Role of zinc andα2macroglobulin on thymic endocrine activity and on peripheral immune efficiency(natural killer activity and interleukin － 2 in cervical carcinoma［ J］．Br J Cancer，1999，79(2):244 －250．

［9］ Singleton AB，Gibson AM，McKeith IG，et al．α2－Macroglobulin polymorphisms in Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies［J］．Neuroreport，1999，10(7):1507－1510．

［10］ Rudrasingham V，Wavrant－De Vriéze F，Lambert JC，et al．α － 2 macroglobulin gene and Alzheimer disease［J］．Nat Genet，1999，22(1):17 －19．

［11］ Tortorella MD，Arner EC，Hills R，et al．α2－ Macroglobulin is a novel substrate for ADAMTS－4 and ADAMTS－5 and represents an endogenous inhibitor of these enzymes［J］．J Biol Chem，2004，279(17):17554 －17561．

［12］ Luan Y，Kong L，Howell DR，et al．Inhibition of ADAMTS－7 and ADAMTS－12 degradation of cartilage oligomeric matrix protein by alpha－2－macroglobulin［J］．Osteoarthritis Cartilage，2008，16(11):1413 －1420．

［13］ Abbink JJ，Kamp AM，Nieuwenhuys EJ，et al．Predominant role of neutrophils in the inactivation ofα2－macroglobulin in arthritic joints［J］．Arthritis Rheum，1991，34(9):1139－1150．

［14］ 張 洪，張陽德，張宗久，等．α2M在骨關節炎動物模型中的表達及意義［J］．中國現代醫學雜志，2008，18(1):40 －41，46．

［15］ 林子洪，何愛珊，傅 明，等．前交叉韌帶切除后半月板變化及α2－巨球蛋白干預效果的初步研究［J］．中華關節外科雜志:電子版，2010，4(1):93 －99．

［16］ 李蔚勃，曹佩華，曹峻嶺．α－2巨球蛋白對骨關節炎的影響［J］．國外醫學:醫學地理分冊，2006，27(1):1 －5．