中藥制劑對大腸桿菌耐藥性逆轉的作用研究

張秀英，宋 立，趙 暉，趙富華，段文龍，孫玉梅，范 強

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

在養殖業發展過程中，抗菌藥物發揮了重要的作用，但抗菌藥物長期濫用和低劑量使用，使動物源耐藥病原菌的產生與擴散，造成治療失敗，對養殖業帶來很大的損失。有證據表明，自允許在食品動物中使用氟喹諾酮類抗菌藥物后，耐氟喹諾酮類菌明顯增多，出現了多重耐藥，耐藥性已經成為二十一世紀人們亟待解決的難題［1-2］。在中藥抗感染治療中，細菌對抗感染中藥及其復方不易產生耐藥性，且部分中藥具有延緩、消除耐藥性的現象，增加了對抗細菌耐藥性的措施與策略［3］。本文從我國傳統中藥入手，以突變恢復為理論依據，選擇復方蒼術口服液和復方十大功勞顆粒作用恩諾沙星耐藥菌株，使耐藥大腸桿菌恢復對恩諾沙星的藥物敏感性。

1 材料與方法

1.1 試驗菌 大腸桿菌5株:均分離于健康豬肛拭子，1#(2009年分離于天津某健康豬場)、2#(2009年分離于天津某健康豬場)、3#(2008年分離于南寧某健康豬場)、4#(2007年分離于江蘇某健康豬場)和5#(2007年分離于江蘇某健康豬場)，由中國獸醫藥品監察所耐藥性監測實驗室分離和鑒定;標準質控菌株CMCC 44113，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 培養基 營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基和水解酪蛋白肉湯，從中國獸醫藥品監察所基礎保障室提供。

1.3 藥品和試劑 恩諾沙星對照品(批號H0080807，含量 99.5%)、硫 酸小檗堿 (批號20080201，含量 90.0%)和鹽酸小檗堿(批號Z0220712，含量:98.7.0%)由中國獸醫藥品監察所提供;巴馬汀對照品(批號:110732-200907，含量:100.0%)和鹽酸藥根堿(批號:0733-200005，含量:100.0%)，購自中國藥品生物制品檢定所;復方蒼術口服液(每100 mL相當于原生藥366 g，批號20080802)和復方十大功勞顆粒(每50 g相當于原生藥500 g，批號20080802)，由某單位提供;乙腈和甲醇為色譜純試劑;磷酸二氫鉀、磷酸等為國產分析純試劑。

1.4 藥物溶液的制備

1.4.1 恩諾沙星貯備液 準確稱取恩諾沙星對照品約51.3 mg，先加約一半的水，然后滴加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液溶解后，用水稀釋至10 mL，配制成5120 μg/mL的溶液。

1.4.2 硫酸小檗堿貯備液 取硫酸小檗堿210.5 mg，用水稀釋至25 mL，配制成8 mg/mL的溶液。

1.4.3 復方十大功勞貯備液的制備 取復方十大功勞顆粒1 g，加滅菌水10 mL溶解，制成每1 mL中含生藥1 g的溶液。

1.4.4 復方蒼術口服液貯備液 取原液作為貯備液

1.4.5 液相對照品溶液 準確稱取鹽酸小檗堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品和鹽酸藥根堿對照品適量，加乙腈-水(3∶7)混合溶液制成每1 mL含100 μg、50 μg 和50 μg 的溶液。

1.4.6 液相藥物溶液 取供試品1 g，精密稱重，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)混合溶液50 mL。超聲處理30 min，放冷，搖勻，濾過，即得。

1.5 主要儀器 高效液相色譜儀:Waters 2695色譜儀、2487紫外檢測器、自動進樣器;數字比濁儀99234，威泰科學有限公司。

1.6 中藥制劑中生物堿含量的測定［4］以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調pH值至3.0)(30∶70)為流動相;檢測波長為265 nm。理論板數按小檗堿峰計算應不低于5000。取液相對照品溶液和藥物溶液，分別用0.22 μm濾膜過濾后，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。

1.7 最小抑菌濃度測定［5］取測試菌用劃線法涂布普通瓊脂平板，35℃培養16～24 h，挑取3～4個單個菌落，用4 mL無菌生理鹽水配成0.5麥氏單位的菌懸液，用M-H肉湯稀釋100倍，配制成約5×105～106CFU/mL濃度。將各藥物貯備液用M-H肉湯稀釋10倍后，在96孔板的第1個孔中加入0.1 mL，然后按2倍稀釋法逐步稀釋至一系列所需濃度，每孔抗生素溶液體積為0.1 mL，設陰性和陽性對照。然后往各孔板中分別加入0.1 mL菌液，混勻。置35℃培養16～20 h，取出培養后的板，觀察結果，在標準質控菌株的最低抑菌濃度符合規定范圍［6］(恩諾沙星的 MIC 為 0.008 ～ 0.03 μg/mL)的前提下，以無菌生長的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

1.8 中藥制劑的耐藥逆轉作用研究 取復方蒼術口服液0.25 mL和復方十大功勞顆粒0.25 g，分別加營養肉湯至1 L，加入各試驗菌從1代連續傳代培養。培養條件為:35±2℃，培養16～20 h。同時用肉湯培養基傳代作為陰性對照(營養肉湯中不含藥物)。每代培養后測定耐藥菌對恩諾沙星的MIC，觀察MIC的變化。

1.9 染色體耐藥基因突變的檢測 根據Genbank公布的 gyrA、gyrB、parC和 parE這四種基因的QRDRs序列，采用Primer 5.0軟件設計相應引物，引物序列為:gyrA F:TGCGATGTCGGTCATTGTT，R:CGTTCACCAGCAGGTTAGG。gyrB F:AAAAGCCAAAGTTAGCGCCACCG，R:CACGACCGATACCACAGCCAAGC。parC F:CGTGCGTTGCCGTTTATT，R:GCAGGTTATGCGGTGGAAT。ParEF:CGATGCGTGAGTTCTGTGA，R:GTTCGGCTTGCCTTTCTT。以煮沸法提取大腸桿菌DNA作為模板，進行PCR擴增，反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性45 s，各對引物退火45s，72 ℃延伸1 min，32個循環;最后72℃延伸5 min。將陽性基因片段測序，確認染色體DNA的突變狀況。

2 結果

2.1 中藥制劑中生物堿的含量 復方十大功勞顆粒中含有小檗堿、巴馬汀和藥根堿的濃度為0.01 mg/mL、0.006 mg/mL 和 0.02 mg/mL;復方蒼術口服液中未檢出上述3種成分。

2.2 大腸桿菌的MIC 采用從不同地區篩選分離得的5株豬源大腸桿菌測定，5株菌均對恩諾沙星不同程度的耐藥，測定的 MIC范圍為32～640 μg/mL，選擇5株作為測試菌株，耐藥狀況見表1。測定5株耐藥菌株對硫酸小檗堿、復方蒼術口服液和復方十大功勞顆粒的MIC，結果硫酸小檗堿對5株菌株的MIC均大于2 mg/mL;復方蒼術口服液和復方十大功勞顆粒對5株菌均無抑菌作用。

表1 5株菌對恩諾沙星和硫酸小檗堿的MIC

2.3 中藥制劑的耐藥逆轉作用 結果3株菌株在加有2種藥物培養基中傳代7代后，MIC均降低了8倍以上，耐藥株逆轉率為60%。陰性對照的MIC均在質控范圍內。

2.4 染色體耐藥基因的測定結果 經過中藥作用后，MIC降低的菌株，GyrA和ParC上發生了有意義的變化，由原來的耐藥突變狀態，恢復到了敏感的正常狀態。表3中列出了變化的堿基和氨基酸位點。2號菌株經藥物作用以后，MIC降低的同時，GyrA上的83位氨基酸恢復為正常的氨基酸序列(Leu→Ser)。3號菌株ParC基因80位氨基酸也由原來的氟喹諾酮耐藥性突變狀態轉變為正常狀態(Ile→Ser)，其他位點的氨基酸突變與氟喹諾酮耐藥性無關。

表2 中藥培養后恩諾沙星的MIC變化匯總表

表3 中藥作用前后菌株染色體堿基(氨基酸)的變化

3 討論

3.1 采用棋盤稀釋法考察中藥制劑與恩諾沙星聯用對5株大腸桿菌的抑菌效果，但聯用后無明顯的增效作用;而通過將中藥制劑加入大腸桿菌培養基中，選擇性培養耐藥性大腸桿菌，經過一定代次后，細菌的耐藥性逆轉，MIC降低8倍以上，說明復方十大功勞顆粒或復方蒼術口服液與恩諾沙星聯用不能增強恩諾沙星對耐藥大腸桿菌的敏感性，但中藥制劑單獨作用卻可使耐藥細菌恢復敏感性，此時再用恩諾沙星治療就能取得較好療效。

3.2 復方十大功勞顆粒中含有小蘗堿、巴馬汀和藥根堿等有效中藥成分，復方蒼術口服液中不含上述成分，兩者雖然成分不相同，但均可逆轉大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥性，看來本試驗中耐藥性的逆轉與上述3種成分無直接關系，可能是中藥各成分的綜合抗菌能力對細菌作用的結果，中藥通過消除R質粒、抑制主動外排泵和改變細菌生物膜的通透性等作用機制，從而使細菌恢復敏感性［7-9］。喹諾酮類藥物的一個主要耐藥機制:編碼DNA旋轉酶gyrA和gyrB及編碼拓撲異構酶IV parC和parE的基因突變(gyrB和parE較少見)，臨床分離的雞大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥水平與GyrA和ParC的突變密切相關，3株細菌耐藥染色體基因突變導致的gyrA和ParC上的氨基酸替換是細菌恢復藥物敏感性的根本原因。秦春明等也通過試驗研究，證明大黃素能逆轉耐藥細胞株對順鉑的耐藥性，對順鉑的逆轉倍數分別為1.91 倍和1.30 倍［10］，這是因為與耐藥基因表達下調有關。李乾學等提示臨床分離的雞大腸桿菌O78的耐藥水平與喹諾酮類藥物的選擇性壓力有關，它誘導了DNA旋轉酶和拓撲異構酶IV的基因突變［10］。

3.3 細菌耐藥性和耐藥菌感染是當前急待解決的問題，但僅憑抗菌藥物又一時難以解決問題。中藥抗感染的歷史經驗和優勢，已經為動物的疾病治療發揮了重要作用。雖然中藥作為耐藥抑制劑還處于初級階段，中藥的作用機制探討不深，在今后的研究中應當以中醫辯證論治作理論指導，結合中藥四性五味，以現代藥物研究方法為手段，抓住治療耐藥細菌感染研究的契機，開拓中藥制劑治療耐藥菌感染的領域。

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