焦磷酸測序技術檢測耐多藥結核分枝桿菌

朱長太，鄭瑞娟，王 潔，胡忠義

(同濟大學附屬上海市肺科醫院，上海200433)

近年來隨著，耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)、廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)的出現和蔓延，使得結核防控更加困難[1,2]。建立可靠的結核耐藥檢測方法對于結核病的治療及防控無疑具有重要意義。由此，本文旨在建立一種結核分枝桿菌菌株耐多藥快速檢測方法，并評價其在臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 202株被BACTEC 960藥敏證實為MDR-TB臨床分離株為上海市肺科醫院2010年至2011年臨床確診的肺結核患者的痰標本培養陽性菌株。

1.1.2 主要儀器 PSQ96全自動焦磷酸測序儀 (瑞典Biotage公司)、基因擴增儀 (德國Eppendorf公司)、BACTEC MGIT 960檢測儀 (美國 Dickinson公司)、Gene Genius全自動凝膠成像分析系統 (英國Syngene 公司)。

1.1.3 主要試劑 焦磷酸測序試劑盒、鏈親和素包被的磁珠均為瑞典PYROSEQUENCING AB公司產品，Bactec 960試劑購自美國Dickinson公司，Taq酶等PCR擴增體系試劑均為大連寶生物工程有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取保存于改良羅氏培養基的結核分枝桿菌，接種于Middlebrook 7H9液體培養基，37℃培養2～3周后取1.0 ml液體培養物，80℃水浴保溫30 min滅活菌株，10 000 r/min，離心10 min棄上清，雙蒸水洗滌沉淀后將菌體沉淀重懸于 50μl裂解液中，50℃水浴 1 h，沸水浴 10 min，離心去上清。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 使用PSQ96MA系統自帶軟件Pyrosequencing TM Assay Design軟件，設計rpoB、katG基因PCR擴增引物和焦磷酸測序引物，設計的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。各耐藥基因PCR反應體系為50μl：基因組模板2.0μl，4種脫氧核苷三磷酸的終濃度各為0.2 mmol/L，上、下游引物的終濃度各為0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR反應循環參數除退火溫度為：95℃預變性5 min；94℃30 s，72℃ 30 s，共 50個循環，72℃延伸 10 min。PCR產物固定后，純化單鏈模板，進行焦磷酸測序。運用Identifire分析軟件，將測序所得序列與MTB標準菌株耐藥基因序列進行比對，確定結核桿菌臨床分離株各基因的突變類型和突變位置。

1.2.3 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行數據處理，計算焦磷酸測序技術檢測MDR-TB的靈敏度及特異度。

1.2.4 質量控制 MTB標準菌株(H37Rv,ATCC27294)為本研究的質控株。

2 結果

本研究中，我們確定表1中DNA序列作為rpoB、katG基因PCR擴增引物和焦磷酸測序引物來檢測結核菌利福平及異煙肼耐藥性。我們以焦磷酸測序同時檢測到rpoB基因及katG基因突變判讀為MDR-TB，結果顯示：202株結核分枝桿菌臨床分離株中，焦磷酸測序檢測到MDR-TB共計154株；以BACTEC MGIT 960檢測結果為判讀標準，則焦磷酸測序法檢測MDR靈敏度為72.8%[95%可信區間 (confidence interval:CI):66.3%～78.4%]，特異度為 90.0%(95%CI:80.1～95.1%)。 耐多藥結核分枝桿菌焦磷酸測序檢測結果表2。

表1 rpoB、katG基因PCR擴增引物和焦磷酸測序引物

表2 耐多藥結核分枝桿菌焦磷酸測序檢測結果

3 討論

結核病耐藥是目前全球關注的一個公共衛生問題，已嚴重威脅到人類的健康。目前結核耐藥檢測常規方法多采用細菌學藥敏方法，該方法所需時間長，不能及時為臨床提供用藥指導。焦磷酸測序技術是一種新近發明的以檢測DNA合成過程中所產生的焦磷酸為基礎的實時DNA測序技術[3,4]。焦磷酸測序技術實際上依靠四種酶(DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)及兩種底物(APS和熒光素)完成。與Sanger法不同，焦磷酸測序技術依賴于核苷酸摻入中焦磷酸鹽的釋放，而非雙脫氧核苷三磷酸參與的鏈終止反應[5]。目前，焦磷酸測序技術已被廣泛應用于病原微生物快速鑒定、病毒與細菌分型、突變檢測及藥物基因組學等各個方面[6-9]。

本研究我們建立焦磷酸測序檢測異煙肼、利福平藥物耐藥性方法，BACTEC 960法以利福平及異煙肼同時耐藥判讀為MDR，而焦磷酸測序法以同時檢測到rpoB基因及katG基因突變判讀為MDR。在202株結核分枝桿菌臨床分離株中，焦磷酸測序檢測到MDR-TB共計154株。以BACTEC960檢測結果為判讀標準，焦磷酸測序法檢測MDR靈敏度為72.8%(95%CI:66.3%～78.4%)， 特異度為 90.0%(95%CI:80.1%～95.1%)。從研究結果來看，新確立的焦磷酸測序技術可檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼的耐藥性，具有較高的特異性與靈敏度。與Sanger法相比，焦磷酸測序技術具有高通量、低成本、檢測報告時間更短等優勢[9]，由此我們認為新建立的焦磷酸測序技術可作為耐多藥結核分枝桿菌藥敏實用的檢測工具，值得臨床推廣應用。

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