1株非嗜肺軍團菌的鑒定

李曲文，原 靈，陳愛平，楊勁松

(福建省疾病預防控制中心，福建 福州350001)

軍團菌病是由軍團菌感染引起的一種急性細菌性呼吸道傳染病，該病傳播途徑是經呼吸道，以氣溶膠的形式傳播。隨著城市經濟的快速發展，大型建筑物的興建及隨之而來中央空調系統、冷卻塔、淋浴設施等現代化設備的廣泛使用，人們的暴露機會也會隨著增多，軍團菌病流行和暴發的危險性也日益增加，目前該病已成為世界各國及我國普遍關注的公共衛生問題[1]。由軍團菌引起的疾病有軍團菌肺炎、龐蒂亞克熱(Pontiac fever)等，大部分由嗜肺軍團菌引起，但非嗜肺軍團菌也能引起人類疾病[2]。我省2012年7月從一份中央空調冷卻塔水中分離出1株疑似非嗜肺軍團菌并進行了鑒定分析，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 GVPC平板、BCYE-α 平板、BCYE-cys平板及血平板購自廣州環凱微生物科技有限公司，在有效期內使用。生化反應管購自北京友康有限公司。軍團菌乳膠試劑購自英國OXOID公司，嗜肺軍團菌診斷血清購自日本生研。PCR反應試劑：Ex Taq 酶、dNTP、10×Buffer、DL 2000 Marker、Wide range DNA Marker(100-6,000)購自 Takara 公司，實驗中使用的引物由上海生工合成，瓊脂糖、溴化乙錠(10mg/m1)等購自上海生工公司。

1.2 儀器 軍團菌培養及鑒定裝置包括：TGL-16B臺式高速離心機、水平電泳槽、生物安全柜、CO2培養箱、三聯抽濾裝置 (濾膜 Millipore，0.45μm)。PCR實驗儀器包括：英國G-Storm PCR儀，上海培清科技有限公司JS-380A自動凝膠成像分析儀，Bio-rad公司電泳儀和電泳槽，德國Sigma1-14離心機。

1.3 樣品處理與分離培養 參照衛生部2006年衛生部 《公共場所集中空調通風系統衛生規范》及《ISO 11731水樣軍團菌檢測》。將采集的300ml水樣搖勻后，用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，將過濾后的濾膜剪碎于5ml水樣中震蕩洗脫，分別取洗脫液各1ml進行酸處理及熱處理，將酸處理及熱處理后的水樣分別取0.2ml分別涂布于GVPC平板上；另將洗脫液不作處理取0.1ml涂布于GVPC平板上；將上述涂布樣品的GVPC平板均置37℃、5%CO2環境中培養3～10d，3d后，每天觀察平板菌落生長情況。

1.4 細菌生化鑒定及分型 在每個平板上挑取可疑菌落做革蘭染色鏡檢，形態符合的菌落轉種在BCYE-α、BCYE-CYS 和血平板上，置 37℃、5%CO2環境中培養3～5d，進行生長鑒定試驗，第2d生長的菌不是軍團菌，3d后，凡BCYE-α平板上生長，而BCYE-CYS及血平板上均不生長的可疑菌落接種生化管，同時做觸酶試驗，生化符合的可疑菌株再進行乳膠凝集試驗及軍團菌診斷血清進行血清分型。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 DNA模板制備 按常規PCR檢測方法進行，模板制備(煮沸法)：在生物安全柜中將菌苔(3滿環)輕輕刮至1.0ml Eppendorf離心管中，用0.1ml純水重懸，煮沸 15min后，12000r/min離心 3min，取上清作為PCR擴增反應的DNA模板。

1.5.2 PCR引物 5srRNA引物序列參考文獻[3],16SrRNA基因引物系列參照中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所舉辦 《軍團菌培訓班講課資料》,mip基因引物序列參照文獻[4]。引物由上海生工合成。5SrRNA引物序列 F：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA -3’、R: 5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’,片段大小(104bp);16SrRNA 引物序列:F:5’-GAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’、R:5’-CGGTCAACTTATCGCGTTTGCT，片段大小 (430bp)；mip 引物序列：F:5’-GGTGACTGCGGCTGTTATGG-3’、R:5’ -GGCCAATAGGTCCGCCAACG-3’，片段大小(630bp)。

1.5.3 PCR操作程序 反應總體積50μl，在PCR管中按順序加入34.0μl純水，10×Buffer(Mg-Cl22.5mmol/L)5.0μl，dNTP(2.5mmol/l)4.0μl，上下游引物 (20μmol/L) 各 1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，最后加入模板 5.0μl，雙蒸水作試劑空白對照，陽性對照為嗜肺軍團菌標準株(LP1)由本科室菌種組保存。反應條件：(1)5SrRNA基因：94℃預變性 5min，94℃30s，48℃30s，72℃60s，共 30 個循環，72℃延伸 3min；(2)16S rRNA 基因：94℃預變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30個循環，72℃延伸 3min；(3)mip基因：94℃預變性 5min，94℃30s，48℃30s，72℃60s，共30個循環，72℃ 延 伸3min。取擴增產物5μl上樣于1.2%瓊脂糖凝膠中，以DL2000Marker(Wide range DNA Marker(100～6,000))為標準分子量,5V/cm的電場強度于0.5×TBE電泳緩沖液中電泳40min后,用凝膠成像儀拍照。

2 結果

2.1 培養基上生長特征 水樣在GVPC平板上培養3d長出細小菌落，培養7d長出棕褐色、圓形稍凸、濕潤光滑菌落，菌落挑起有黏絲狀。

2.2 革蘭染色鏡檢 染色鏡檢為革蘭陰性短桿菌或呈細長頭發絲狀。

2.2 生長驗證試驗結果 將可疑菌落轉種BCYE-α、BCYE-CYS 和血平板上，置 37℃、5%CO2環境中培養3～5d，結果可疑菌落在BCYE-α平板上生長，而在BCYE-cys及血平板上均不生長。

2.4 生化試驗 可疑菌落做觸酶試驗、氧化酶試驗和接種生化管等試驗，結果為：觸酶陽性、明膠液化試驗陽性；氧化酶、馬尿酸鹽水解、硝酸還原、糖發酵、尿素酶試驗均為陰性。

2.5 血清分型 乳膠凝集試驗結果顯示本菌株與非嗜肺軍團菌乳膠凝集，與嗜肺軍團菌乳膠不凝集；用軍團菌診斷血清進行玻片凝集試驗顯示和嗜肺軍團菌血清 L.gormanii、L.micdadei、L.bozemanii和L.dumoffii不凝集。

2.6 分子生物學鑒定結果 用軍團菌屬特異性基因5SrRNA和16SrRNA，嗜肺軍團菌特異性診斷基因mip進行PCR鑒定，結果如圖1。

圖1 PCR鑒定結果

結果顯示該菌株5SrRNA基因陽性、16SrRNA基因陽性，mip基因陰性。

2.7 結合常規分離培養鑒定 血清學及分子生物學鑒定，結果判定該菌株為軍團菌屬非嗜肺軍團菌種，血清尚未分型。

3 討論

軍團菌病是一種急性細菌性呼吸道傳染病，具有病程進展快，病死率高、易爆發流行的特點，其病原體軍團菌廣泛分布于自然界各種自然水源以及空調水、管道供水系統等人工水源中，而含有軍團菌水產生的氣溶膠是軍團菌病主要傳播途徑。國內外對軍團菌的研究證實軍團菌病的流行及傳播與集中空調、熱水設備等現代生活設施的人工水環境密切相關[5]。由集中空調及供水系統引發的軍團菌對水質、空氣的污染已成為當今社會關注的一個重要的公共衛生問題。本文檢出的非嗜肺軍團菌是我省首次在冷卻塔水中檢出的非嗜肺軍團菌，據報道非嗜肺軍團菌也能引起人類疾病[2]。

本例為少見的產棕褐色素的軍團菌屬，一般軍團菌在BCYE上菌落生長特點以灰白色菌落多見。5SrRNA基因、16SrRNA基因是軍團菌的屬特異性基因，mip基因是軍團菌的嗜肺軍團菌種特異基因。Mahbubani[3]報道應用5SrRNA基因檢測軍團菌屬特異性,可檢測到104bp基因片段,該序列較為保守,種間差異較小。16SrRNA是微生物核糖體RNA，在物種進化中保持相對的恒定的結構，具有種屬的特異性，因此常作為物種鑒定的基因。鑒于軍團菌基因組DNA龐大的數字,其他方法就無法對基因組進行分析,需要使用一些具有代表性的序列,所以選擇特異性較高的軍團菌種屬特異性序列就具有了重要的意義。16SrRNA和5Sr-RNA可用來區分軍團菌和非軍團菌。mip基因編碼巨噬細胞感染增強子蛋白,是一種在多種胞內寄生菌的細菌表面均有表達的外膜蛋白,對嗜肺軍團菌進入到阿米巴和巨噬細胞有促進作用,同時破壞了細胞的殺菌功能，mip基因有足夠的序列差異來區別嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌[6]。5Sr-RNA基因檢測軍團菌屬特異性,可檢測到104bp基因片段,該序列較為保守,種間差異較小。對絕大部分軍團菌種的16SrRNA序列已被測定,種間差異比較明顯,可以鑒定大部分軍團菌種,但是其變異程度還不足以區分不同的血清型,目前，已確認的軍團菌有50種，70多個血清型，接近20種有臨床分離報道。本實驗室購買到的非嗜肺軍團菌診斷血清只有四種，檢出的菌落不與其發生凝聚，結合分離培養鑒定、血清學及分子生物學鑒定結果為軍團菌屬非嗜肺軍團菌種，血清尚未分型。

雖然90%的軍團菌爆發是由嗜肺軍團菌引起，但是非嗜肺軍團菌引起的病例也時有發生。聯合5SrRNA基因、16SrRNA基因，mip基因能很好的鑒定軍團菌屬與非軍團菌屬，嗜肺與非嗜肺軍團菌。PCR方法靈敏度高，除能檢測活菌外，還可檢測已死亡的菌體DNA，因此若水中存在極微量的軍團菌或死菌時，PCR方法能檢出，但傳統分離方法卻是陰性。另PCR引物不但能檢測致病性軍團菌，也能檢測非致病性軍團菌，方法的敏感性高和有高度特異性，與傳統方法吻合率高，適合作為傳統檢測方法的補充，提高檢測速度和準確度。進行分子生物學鑒定以防漏檢，對于防范軍團菌病的爆發與流行起了防控作用。

[1]原 靈,陳愛平,詹鑾峰,等.福建省2008年公共場所中央空調冷卻塔水軍團菌污染狀況調查 [J].中國人獸共患病學報,2010，26(11)：1080-1081.

[2]何 暉,龔玉嬌,馬 林,等.一株嗜肺軍團菌的分型和定量[J].熱帶醫學雜志,2005,4(02)：195-196.

[3]Mahbubani MH,Bej AK,Miller R,et al.Detection of legionella with polymerase chain reaction and gene probe methods[J].Mol Cell Probes,1990,4(3):175-187.

[4]Jaulhac B,Nowicki M,Bornstein N,et al.Detection of Legionella spp.in bronchoalveolar lavage fluids by DNA amplification[J].J Clin Microbio,l992,30(4):920-924.

[5]馮文如,馬 林,劉漢湘.廣州市公共場所空調冷卻塔水中軍團菌污染狀況調查[J].華南預防醫學,2005,31(3)：60-61.

[6]宣瑞紅，胡朝輝，朱慶義.軍團菌分子生物學分型測定及其實用性研究進展[J].中國預防醫學雜志,2010,11(1):103-105.