流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定蘋(píng)果多酚抗氧化活性

劉彩紅，李玉琴，*，李 珂，賈寶秀，郭玉蓉

（1.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271000；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定蘋(píng)果多酚抗氧化活性

劉彩紅1，李玉琴1，*，李 珂1，賈寶秀1，郭玉蓉2

（1.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271000；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定蘋(píng)果多酚的體外抗氧化作用。將蘋(píng)果多酚提取液加入3種化學(xué)發(fā)光體系，測(cè)量其發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光被抑制的程度評(píng)價(jià)蘋(píng)果多酚對(duì)活性氧自由基的清除能力，并以抗壞血酸（VC）為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明，蘋(píng)果多酚對(duì)三種活性氧自由基（O2-·、·OH、H2O2）的清除能力遠(yuǎn)強(qiáng)于VC；對(duì)H2O2和·OH的清除能力相當(dāng)，強(qiáng)于對(duì)O2-·的清除能力。結(jié)果顯示蘋(píng)果多酚具有很好的抗氧化能力。

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光，蘋(píng)果多酚，抗氧化

多酚類物質(zhì)是蘋(píng)果中重要的生物活性成分之一，由于能影響蘋(píng)果汁的顏色、風(fēng)味，如苦澀味、收斂性等而倍受關(guān)注。其主要成分為類黃酮類化合物，具有抗癌、抑制高血壓和高血脂、抑菌[1-3]等多種藥理功能。研究表明，多酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化能力，因此本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法對(duì)蘋(píng)果中多酚類物質(zhì)清除活性氧自由基（O2-·，·OH，H2O2自由基）的能力進(jìn)行了快速體外篩選，并將其與維生素C（VC）的清除能力進(jìn)行對(duì)比，為蘋(píng)果采后加工工藝過(guò)程中多酚類物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋(píng)果 煙臺(tái)；魯米諾 sigma公司；福林酚試劑 北京索萊寶科技有限公司，1mol·L-1，避光冷藏；沒(méi)食子酸、鄰苯三酚、維生素C、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、過(guò)氧化氫等試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為二次蒸餾水。

IFFM-D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀 西安瑞邁科技有限公司；UV-2450PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 鄰苯三酚溶液用lmmol·L-1的HCl溶液配制，使用前用二次蒸餾水稀釋至所需濃度，魯米諾用0.lmol·L-1的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液配制成所需濃度；亞鐵氰化鉀、魯米諾以及H2O2均用KH2PO4-NaOH（pH7.20）緩沖溶液配制，使用前配制。

1.2.2 蘋(píng)果多酚的提取[4]紅富士蘋(píng)果清洗后，切塊，加0.1%異VC，破碎后精確稱取10g樣品于帶塞錐形瓶中，按料液比1∶6加入60%的乙醇，超聲波提取20min，然后抽濾，所得濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，離心20min，轉(zhuǎn)速3000r·min-1，取其上清液備用。

1.2.3 蘋(píng)果多酚含量測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取25mg沒(méi)食子酸，用50%甲醇定容至50mL，然后配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液lmL，加入1mL Folin-Ciocalteu試劑，充分混勻后加入10mL 7%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25mL，不時(shí)振蕩，2h后，在768nm下測(cè)吸光度，以50%甲醇作空白。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)作圖，進(jìn)行曲線擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.1109+ 0.1523C（r=0.9918）。

1.2.3.2 樣品總酚含量測(cè)定 準(zhǔn)確吸取1mL樣品液，置25mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)制備方法測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，得樣品液中總酚含量為29.2mg·L-1。

1.2.4 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光 按圖1設(shè)計(jì)的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析流路，蠕動(dòng)泵分別泵入a鄰苯三酚溶液、b魯米諾-碳酸鹽緩沖液和c H2O（·OH體系中，蠕動(dòng)泵分別泵入魯米諾、亞鐵氰化鉀溶液以及H2O2溶液；H2O2自由基體系中分別泵入H2O2、魯米諾-碳酸鹽緩沖液和H2O），分別在混合器中混合并發(fā)生反應(yīng)，記錄發(fā)光信號(hào)。當(dāng)蠕泵中進(jìn)的是空白溶液時(shí)，發(fā)光信號(hào)為空白值I0，當(dāng)進(jìn)的是待測(cè)液或VC溶液時(shí)，發(fā)光信號(hào)記為IT，根據(jù)發(fā)光信號(hào)的降低值（I0-IT），可以定量分析蘋(píng)果多酚與維生素C清除自由基的能力。自由基抑制率為：

以發(fā)光抑制率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪出發(fā)光抑制曲線，并計(jì)算自由基抑制率為50%時(shí)的濃度IC50，用來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除自由基能力越強(qiáng)[5]。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光示意圖Fig.1 Flowchat of flow injection chemiluminescence

1.2.5 O2-·清除能力檢測(cè) 采用鄰苯三酚－碳酸鹽緩沖溶液－魯米諾體系測(cè)定，鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生O2-·，O2-·與化學(xué)發(fā)光增效劑魯米諾反應(yīng)，使之氧化，產(chǎn)生一個(gè)電子激發(fā)態(tài)的中間物，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)，可發(fā)出化學(xué)冷光，用發(fā)光檢測(cè)裝置即可測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。反應(yīng)體系中O2-·的量可以用化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)相對(duì)表示。測(cè)定中，選擇鄰苯三酚：0.25mmol·L-1；魯米諾：0.4mmol·L-1；NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液pH：9.95，此時(shí)體系的發(fā)光強(qiáng)度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好。

1.2.6 ·OH清除能力檢測(cè) ·OH由Fe2+催化的Fenton體系產(chǎn)生，魯米諾為發(fā)光增效劑，采用亞鐵氰化鉀-魯米諾-H2O2體系測(cè)定。根據(jù)反應(yīng)物和魯米諾的濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度、穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇亞鐵氰化鉀：0.26mmol·L-1；魯米諾：0.1mmol·L-1；H2O2含量：0.2%。

1.2.7 H2O2清除能力檢測(cè) 采用魯米諾-過(guò)氧化氫碳酸鹽緩沖溶液體系測(cè)定，堿性條件下，過(guò)氧化氫氧化魯米諾使之發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度與過(guò)氧化氫含量成正比，發(fā)光強(qiáng)度的下降可以體現(xiàn)樣品清除過(guò)氧化氫的能力。實(shí)驗(yàn)中H2O2含量：0.3%；魯米諾：0.2mmol·L-1；NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液pH：9.60。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)O2-·的清除作用

根據(jù)上述條件，分別對(duì)空白溶液、蘋(píng)果多酚提取液及VC溶液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)定，每個(gè)體系重復(fù)測(cè)定3次，發(fā)光強(qiáng)度取平均值。

圖2 蘋(píng)果多酚對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of apple polyphenols on chemiluminescence intensity

圖2所示為蘋(píng)果多酚提取液對(duì)O2-·體系發(fā)光強(qiáng)度的影響，由此看出蘋(píng)果多酚能夠降低該體系的發(fā)光強(qiáng)度，發(fā)光強(qiáng)度降低即表示反應(yīng)物對(duì)O2-·具有抑制能力，說(shuō)明蘋(píng)果多酚對(duì)O2-·具有一定的清除作用。

圖3 VC和蘋(píng)果多酚對(duì)O2-·的清除作用Fig.3 The scavenging ability on O2-·of VCand apple polyphenols

配制不同濃度的蘋(píng)果多酚和VC溶液進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算發(fā)光抑制率，繪制發(fā)光抑制率曲線如圖3。由圖可見(jiàn)，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，蘋(píng)果多酚提取液和VC對(duì)O2-·的清除作用均隨濃度增大而增大。相同條件下，蘋(píng)果多酚提取液對(duì)O2-·的清除作用明顯強(qiáng)于VC，二者的IC50分別為0.47、1.50mg·L-1。

2.2 對(duì)·OH的清除作用

測(cè)定不同濃度的蘋(píng)果多酚和VC溶液對(duì)·OH體系發(fā)光強(qiáng)度的影響，計(jì)算發(fā)光抑制率，并繪制發(fā)光抑制率曲線如圖4。

圖4 VC和蘋(píng)果多酚對(duì)·OH的清除作用Fig.4 Thescavengingabilityon·OHofVCand applepolyphenols

由圖4可知，蘋(píng)果多酚和VC對(duì)·OH有較好的清除作用，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)清除率隨濃度增大而增大。相同條件下，蘋(píng)果多酚提取液對(duì)·OH的清除作用強(qiáng)于VC，IC50分別約為0.20、0.54mg·L-1。

2.3 對(duì)H2O2的清除作用

測(cè)定不同濃度的蘋(píng)果多酚和VC溶液對(duì)H2O2系發(fā)光強(qiáng)度的影響，計(jì)算發(fā)光抑制率，并繪制發(fā)光抑制率曲線如圖5。由圖5可知，蘋(píng)果多酚對(duì)H2O2有很好的清除作用，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系。相同條件下，蘋(píng)果多酚對(duì)H2O2的清除能力遠(yuǎn)高于VC，二者IC50分別約為0.21、1.81mg·L-1。

圖5 VC和蘋(píng)果多酚對(duì)H2O2的清除作用Fig.5 The scavenging ability on H2O2of VCand apple polyphenols

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將蘋(píng)果多酚與VC進(jìn)行對(duì)比可知：蘋(píng)果多酚提取物具有很好的清除活性氧自由基的作用，對(duì)O2-·、·OH、H2O2三種自由基的清除能力遠(yuǎn)強(qiáng)于VC。由IC50值（見(jiàn)表1）可知，蘋(píng)果多酚提取物對(duì)H2O2、·OH的清除能力相當(dāng)，強(qiáng)于對(duì)O2-·的清除能力。

表1 蘋(píng)果多酚和VC的抗氧化活性Table 1 Antioxidation of apple polyphenols and VC

3 討論

研究表明，多酚物質(zhì)的抗氧化活性與其環(huán)結(jié)構(gòu)上羥基的位置和數(shù)目有密切的關(guān)系。蘋(píng)果多酚提取物中的主要成分為綠原酸和黃烷醇類物質(zhì)，均為多羥基取代的苯環(huán)，苯環(huán)上電子的離域作用使酚羥基容易離子化，是很好的氫供體。蘋(píng)果多酚提取物中含有大量的這種供體基團(tuán)，具有很強(qiáng)的提供氫質(zhì)子的能力，能使具有高度氧化性的自由基還原，能夠終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，阻止新的自由基的產(chǎn)生。另外，蘋(píng)果多酚提取物是一個(gè)復(fù)雜的多種酚類物質(zhì)的混合物，因此不排除其中的單一物質(zhì)之間的相互作用，但對(duì)蘋(píng)果多酚提取物中不同酚類物質(zhì)之間的相互協(xié)同作用或拮抗作用還需作進(jìn)一步研究。

[1]王宏.蘋(píng)果渣中多酚物質(zhì)的提取、分離及其抗氧化活性研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2006.

[2]牛鵬飛，仇農(nóng)學(xué)，杜寅.蘋(píng)果渣中不同極性多酚的分離及其體外抗氧化活性研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（3）：238-242.

[3]孫紅男，孫愛(ài)東，蘇雅靜.蘋(píng)果多酚抑菌效果的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（4）：280-284.

[4]金瑩，孫愛(ài)東，崔莉.蘋(píng)果多酚超聲波提取條件的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2005（12）：99-102.

[5]劉榮華，余伯陽(yáng)，邱聲祥，等.山楂葉中多元酚類成分抗超氧陰離子活性研究及構(gòu)效關(guān)系[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（14）：1066-1069.

Determination of antioxidation of apple polyphenols by flow injection chemiluminescence

LIU Cai-hong1，LI Yu-qin1，*，LI Ke1，JIA Bao-xiu1，GUO Yu-rong2
（1.Pharmacy Department of Taishan Medical University，Tai'an 271000，China；2.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China）

The purpose was to determine the scavenging ability on ROS free radical of apple polyphenols in vitro by flow injection chemiluminescence.The determination was based on the inhibition effect of apple polyphenols extraction in three chemiluminescence system，and vitamin C was used as positive control.It was showed that apple polyphenols original liquid can inhibit and clear the ROS such as O2-·，·OH and H2O2effectively，and the scavenging ability was better than vitamin C.The scavenging ability of apple polyphenols on H2O2was much better than O2-·，but was equal to·OH.Conclusion was the apple polyphenols extraction was an excellent natural antioxidant.

flow injection chemiluminescence；apple polyphenols；antioxidation

TS255.1

A

1002-0306（2012）01-0128-03

2010－12－17 *通訊聯(lián)系人

劉彩紅（1976－），女，碩士，講師，主要從事藥物分析的研究和教學(xué)工作。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-蘋(píng)果采后加工技術(shù)研究（Nycytx-08）。