AMP脫氨酶的生化性質研究

葉 煒，田呂明，姚 鵑，趙 劼，楊海珍，呂育財，肖 貝，龔大春，*

（1.三峽大學-艾能麥克德爾米德再生能源實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443002）

AMP脫氨酶的生化性質研究

葉 煒1，田呂明1，姚 鵑2，趙 劼2，楊海珍2，呂育財1，肖 貝1，龔大春1，*

（1.三峽大學-艾能麥克德爾米德再生能源實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443002）

主要從底物濃度、溫度、pH和常見離子等方面對相對分子量56ku左右的腺苷酸脫氨酶的催化作用的影響因素進行研究。通過酶的催化實驗，結果表明：原始底物質量濃度為2.78×10-2g/L、溫度為37℃、pH為5.9時，AMP脫氨酶催化活性最好，IMP的轉化速度最高為1.965×10-2mol/min。同時考察了Cu2+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Na+、Mg2+、Zn2+等陽離子和SO42-、Cl-、NO3-、CO32-、H2PO4-、B4O72-、檸檬酸根、EDTA離子等陰離子對AMP脫氨酶催化能力的影響。結果表明：檸檬酸根離子和Mn2+對AMP脫氨酶有明顯激活性影響，其他離子濃度超過0.01mol/L時對AMP脫氨酶一般有抑制性影響，AMP脫氨酶商品酶在常溫干燥狀態下穩定性很好，4℃存放的酶液半衰期為5.5d。

AMP脫氨酶，酶活，生化性質

腺苷酸脫氨酶（AMP deaminase，EC 3.5.4.6）最早由鼠骨骼肌（Conway，1939）隨后又由人紅血細胞（Chaney，1962）制備，目前工業中通過培養酵母、青霉、曲霉和毛霉發酵產AMP脫氨酶[1]。脫氨酶是構成嘌呤核苷酸代謝循環的三種主要酶類之一，通過凝膠過濾測定相對分子量為48000±2000，通過SDSPAGE測定時相對分子量為60000±3000，屬于疏基酶，每分子含2個活性疏基，其活性能對氯汞甲酸完全抑制，能催化腺嘌呤核苷轉變為次黃嘌呤核苷，再經核苷磷酸化酶作用生成次黃嘌呤，其代謝緩和終末產物為尿酸[2]。AMP脫氨酶是一種氨基水解酶，它能夠定量脫去腺苷酸嘌呤堿基上的氨基，生成IMP和NH3[3]，在食品添加劑上，脫氨酶最大用途是酶解腺苷酸生成IMP用于生產強力味精，它還是核酸酶解法生產呈味核苷酸的重要酶類之一，在酵母提取物的制備中，一般用核酸酶和AMP脫氨酶來增強味道[4]。其他產業上，脫氨酶用于生產細胞的H+緩沖劑。目前，國內外對AMP脫氨酶性質的研究，只有劉軍昌[5]對來源于米曲霉的脫氨酶pH、熱穩定性研究，發現在30℃和pH6的時候酶穩定性較好。Kazuki yoshimune[4]發現來源于煙曲霉的脫氨酶相對分子量為88ku，最適反應溫度為50℃左右及pH為6時酶活力最高，也考察了金屬離子的影響。本文用已知AMP脫氨酶酶活的商品酶進行脫氨酶生化特性的研究，深入了解AMP脫氨酶的催化性質，有利于高核酸酵母的進一步發展，為增加酵母提取物IMP含量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

5’-AMP 上?？笊锛夹g有限公司；腺苷酸脫氨酶商品酶（酶活為16000u/g） 安琪公司提供；其他試劑 均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活測定[5]液態酶酶活測定：移取3mL反應底物（3.475×10-2g/L）在37℃溫度下保溫5min，加入稀釋后的AMP脫氨酶溶液0.1mL，立刻計時反應，反應15min后加入3mL 10%的高氯酸溶液終止反應。

對照樣品方法同上，反應底物保溫后用冰水預冷，加入3mL10%的高氯酸溶液終止反應，再加入0.1mL的樣品。反應結束后，在265nm處，用石英比色皿，以水為參比測量吸光度。

酶活定義：在上述條件下每分鐘吸光值改變0.001，定義為酶的活力單位。

測定固態酶酶活時稱取m（g）固態酶，溶解在1mL溶液中，然后按照上述方法測定。兩種不同狀態酶的酶活計算公式如下：

液體酶活（u/mL）=（△A265×10×K）/（0.001×T）

固體酶酶活（u/g）=（△A265×10×K）/（0.001×T×m）

式中：△A265為空白對照與反應液吸光度的差值；K為酶液稀釋倍數；T為酶的反應時間（min）；m為固態酶的質量（g）。

1.2.2 酶純度及分子量驗證實驗 SDS-聚丙烯酰胺電泳，分離膠為12.5%，濃縮膠5%，pH8.3 Tris-甘氨酸電泳緩沖液，加樣量為20μL，電泳1.5～2h查看公司提供固態酶純度及具體分子量。

1.2.3 酶學性質實驗

1.2.3.1 底物質量濃度對反應速度的影響 準確稱取139mg腺苷酸，用0.08mol/L的NaHCO3溶液定容至10mL，即13.9g/L作為原始底物質量濃度。把原始底物質量濃度稀釋400～1000倍數，配制成3.475×10-2、2.78×10-2、2.317×10-2、1.986×10-2、1.738×10-2、1.544× 10-2g/L不同的質量濃度梯度，在pH為6.0時，與質量濃度0.01g/mL的酶在37℃反應15min，測定△A265，計算反應速度。

1.2.3.2 酶質量濃度對反應速度的影響 配制0.008～0.025g/mL的質量濃度范圍的商品酶，在底物濃度為3.475×10-2g/L，pH為6.0，37℃條件下反應15min，測定△A265，計算反應速度。

1.2.3.3 腺苷酸脫氨酶的最適反應溫度實驗 在27～62℃溫度范圍內，添加0.01g/mL的酶，在底物濃度為3.475×10-2g/L，pH為6.0條件下反應15min，測定△A265，計算反應速度。

1.2.3.4 腺苷酸脫氨酶的最適反應pH實驗 在pH為4.5～7.5范圍內，添加0.01g/mL的酶，在底物濃度為3.475×10-2g/L，37℃條件下反應15min，測定△A265，計算反應速度。

1.2.3.5 陰、陽離子對腺苷酸脫氨酶活性的影響 在0.001～0.1mol/L范圍內，配制不同離子梯度溶液，添加到脫氨酶反應體系中，在底物濃度為3.475×10-2g/L，pH為6.0，37℃條件，反應15min，測定相對酶活?？疾礻栯x子的影響時，陰離子均為硫酸根離子，主要有Cu2+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Na+、Mg2+、Zn2+，濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L五個梯度溶液；考察陰離子的影響時，陽離子均為對酶活無影響的鈉離子，主要有SO42-、Cl-、NO3-、CO32-、H2PO4-、B4O72-、檸檬酸根、EDTA離子，濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L五個梯度溶液。

1.2.3.6 腺苷酸脫氨酶的穩定性研究 固態穩定性：將商品酶在常溫干燥狀態下存放，每周測一次酶活，經過三個月比較相對酶活。酶液穩定性：配制0.01g/mL酶液10mL，在4℃下存放每隔24h，測定酶活，比較相對酶活，考察酶的穩定性。

2 結果與分析

2.1 腺苷酸脫氨酶的鑒定、純度及相對分子量的檢測

采用不連續SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠體積分數為12.5%，濃縮膠為5%，當溴酚蘭達凝膠下部2/3時（約2h）終止電泳。用考馬斯亮藍G-250染液染色3h，經脫色液過夜洗脫，用紫外拍照成像如圖1所示。商品酶一共由4種蛋白組成，相對分子量從大到小分別為56、35、33、27ku，其中56ku的酶濃度較高。經過與專利[6]所闡述的酶的相對分子量57ku相對照和AMP脫氨酶酶活實驗，確定商品酶主要為AMP脫氨酶。該商品酶可以用于酶學生化性質的研究。

圖1 AMP脫氨酶的商品酶SDS-PAGE電泳圖Fig.1 The AMP deaminase enzyme products by SDS-PAGE map

2.2 底物質量濃度的影響

按照1.2.3.1的方法實驗，結果如圖2所示。由圖可知，在底物質量濃度為2.317×10-2g/L以下，酶催化反應速度與底物質量濃度趨近正比關系，反應速度隨著底物質量濃度的增加而增加；當底物質量濃度在2.317×10-2～2.78×10-2g/L時，反應速度上升并趨于穩定。在底物質量濃度為2.78×10-2g/L時反應速度達到最大，即為1.965×10-2mol/min；當底物質量濃度繼續增加時反應速度下降，底物質量濃度是決定酶催化反應速度的主要因素。說明底物濃度過高對脫氨酶的催化作用有一定抑制作用。

2.3 酶質量濃度的影響

按照1.2.3.2的方法實驗，結果如圖3所示。由圖可知，酶的質量濃度在小于0.013g/mL范圍內遞增時，酶催化反應速度與酶質量濃度趨近成正比關系。當酶質量濃度超過0.013g/mL，酶催化速度隨濃度的增加而下降。脫氨酶反應產物NH3和IMP對酶有競爭性抑制作用[5]，產物隨著酶質量濃度的增加而增加，對酶的抑制作用加強，從而降低酶的反應速度。

圖3 酶質量濃度對反應速度的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on reaction speed

2.4 溫度的影響

按照1.2.3.3的方法實驗，結果如圖4所示。由圖可知，在27～37℃之間，隨著溫度的上升，酶的反應速度急劇上升，在37℃時，反應速度到達最高為1.965× 10-2mol/min。隨溫度繼續上升，反應速度急劇下降，但當溫度上升到42℃時下降幅度變小，當溫度超過52℃時，反應速度又開始快速下降。在其他條件相同的情況下，溫度每升高10℃，化學反應速度增加將近一倍，當溫度升高到37℃時，反應速度達到最大。隨溫度繼續上升酶開始變性失活，反應速度快速下降，當溫度上升到42℃，產物NH3游離態減少，降低對脫氨酶的抑制，反應速度下降幅度平緩，但當溫度超過52℃，腺苷酸脫氨酶嚴重變性失活，反應速度又快速下降。為保證酶的有效利用，反應溫度應該控制為37℃。

圖4 溫度對反應速度的影響Fig.4 Effect of temperature on reaction speed

2.5 pH對腺苷酸脫氨酶反應速度的影響

按照1.2.3.4的方法實驗，結果如圖5所示。由圖可知在pH為6以內，反應速度隨pH的增加而增加，在pH為5.9時，反應速度達到最大值，當pH超過6以后，反應速度隨pH的增加而下降。因此酶的最適pH為5.9左右，最適pH=（pK1+pK2）/2=（5.2+6.7）/2=5.95，基本上符合酶的最適pH。脫氨酶也是一種蛋白質，構成蛋白質的氨基酸含有堿性、中性、酸性基團。在一定的pH范圍內，酶既帶有正電荷基團也帶有負電荷基團，而這些基團是構成酶活性點的部分。一種酶只能在一種特定的電荷狀況下才具有催化活性。AMP脫氨酶也是這樣的，隨著pH的變化，具有這種特定電荷狀況的酶只占總酶的一部分，酶的反應速度有個最大值，在最適pH條件下，酶反應速度達到最大。在pH5.5～6.5時，酶相對穩定，酶活在70%以上。

圖5 pH對AMP脫氨酶的影響Fig.5 Effect of pH on AMP deaminase

2.6 陽離子對AMP脫氨酶活性的影響

按照1.2.3.5陽離子考察方案進行實驗，結果見圖6。由圖可知，Cu2+在0.001mol/L對酶活有促進作用，但當濃度上升到0.005mol/L，開始對酶有抑制作用。Mn2+在0.001～0.1mol/L對酶都有促進作用。Al3+在0.01mol/L以內對酶活沒有影響，而超過這個濃度對酶有強烈的抑制作用。Na+對酶活基本上沒有影響，其他離子在0.01mol/L以內對酶活影響不大，當濃度超過0.01mol/L，對酶活都有一定的抑制作用。

圖6 陽離子對AMP脫氨酶酶活的影響Fig.6 Effect of some cations on AMP deaminase

2.7 陰離子對AMP脫氨酶活性的影響

按照1.2.3.5陰離子考察方案進行實驗，結果見圖7。由圖可知，檸檬酸-對AMP脫氨酶有明顯激活性影響，CO32-、EDTA-在0.01mol/L內對酶活有促進作用，而濃度的上升對酶活開始有抑制作用。SO42-對酶活顯著影響，Cl-、NO3-、H2PO4-和B4O72-都對酶活有抑制作用，濃度超過0.01mol/L時抑制作用比較強烈。

圖7 陰離子對AMP脫氨酶酶活的影響Fig.7 Effect of anion on AMP deaminase

2.8 AMP脫氨酶的穩定性研究

2.8.1 固態穩定性 按照1.2.3.6方案實驗，結果如圖8。由圖可知，由于脫氨酶很容易吸潮，商品酶在常溫干燥下存放3個月，相對酶活保持在90%以上，在這段時間無法通過半衰期或者90%遞減時間考察酶的穩定性情況。只能肯定AMP脫氨酶商品酶在常溫干燥情況下有很好的穩定性。AMP脫氨酶具有極易吸潮性，吸潮后有氧氣和水分，使疏基易被氧化，因而降低酶活。在常溫干燥條件下就能保證AMP脫氨酶酶活的穩定。

圖8 存放時間對干燥商品酶酶活的影響Fig.8 Effect of dry goods storage time on the activity of the enzyme

圖9 4℃下的酶液存放時間對酶活的影響Fig.9 Effect of 4℃storage time on enzyme activity

2.8.2 液態穩定性 按照1.2.3.6方案實驗，結果如圖9。由圖可知，酶液在4℃下保存，相對酶活隨著時間的延長而下降，從第4d開始酶活急劇下降，到第7d酶活下降趨于平衡。由于AMP脫氨酶也是一種蛋白質，可能因為水分子會引起酶分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脫氨基作用、還可能會引起天冬氨酸肽鍵的水解、半胱氨酸的氧化、二硫鍵的破壞等，所以，酶分子在水溶液中隨時間的延長酶活力下降。當到第7d時可能是由于酶變性接近完成，變性酶的含量大于未變性酶的含量很多，相對酶活下降趨于穩定。由圖9中還可以看出，在4℃下AMP脫氨酶的半衰期為5.5d。

3 結論

隨著5’-AMP脫氨酶的研究與開發，AMP脫氨酶被廣泛應用于食品，醫學以及其他領域。本研究以AMP脫氨酶商品酶（酶活為16000u/g）為研究對象，采用SDS-PAGE電泳測得AMP脫氨酶的相對分子量約為56ku。結果表明：原始底物質量濃度為2.78×10-2g/L、反應溫度為37℃、pH為5.9時，AMP脫氨酶催化活性最好，IMP的轉化速度最高為1.965×10-2mol/min。不同離子對AMP脫氨酶酶活會產生不同的影響，研究表明：檸檬酸根離子和Mn2+對AMP脫氨酶都有激活性，當激活劑的濃度低于0.05mol/L時，對脫氨酶有更強激活作用。不同濃度的Na+、SO42-對脫氨酶無明顯影響，其他離子濃度超過0.01mol/L對AMP脫氨酶一般都有抑制性影響。AMP脫氨酶商品酶在常溫干燥狀態下的穩定性很好，4℃下酶液的半衰期為5.5d。為高核酸酵母抽提物的發展提供科學依據。

[1]普為民，丁驊孫，陶元器.5’-腺苷酸脫氨酶產生菌選育及發酵生態學研究[J].云南大學學報，1994，16（2）：184-188.

[2]黃仙娥.腺苷脫氨酶活性測定對胸水性質的鑒別作用[J].臨床肺科雜志，2008，13（1）：95.

[3]David J Merkler，Anupam S Wali.AMP deaminase from yeast [J].J Biol Chem，1989，35：21422-21430.

[4]KazuakiYoshimune，Kugimiya，MitsuakiMoriguchi.Purification and characterization of a flavour-enhancing enzyme，thermostable adenosine-phosphate deaminase，from thermophilie Asperillus fumigatus NO 4[J].Annals of Microbiology，55（4）：267-272.

[5]劉軍昌，段作營，毛忠貴.AMP脫氨酶活性測定的一種改進方法[J].食品與發酵工業，2001，27（7）：30-33.

[6]天野酶株式會社.放線菌來源的AMP脫氨酶及其應用[P]. CN 1950501A，2007-04.

Study on the biochemical characteristics of AMP deaminase

YE Wei1，TIAN Lv-ming1，YAO Juan2，ZHAO Jie2，YANG Hai-zhen2，LV Yu-cai1，XIAO Bei1，GONG Da-chun1，*
（1.Alan G.Macdiamid Institute of Renewable Energy，China Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Angel Yeast Co.Ltd.，Yichang 443002，China）

The effects of the substrate concentration，temperature，pH value，and the other common ion on the catalytic action of Adenosine Deaminase with about 56ku molecular weight were studied.The best catalytic conditions such as the substrate concentration 2.78×10-2g/L，temperature 37℃，and pH value 5.9 were obtained，which the highest catalytic conversion rate was 1.965×10-2mol/min.Meanwhile，Cu2+，Fe2+，Al3+，Mn2+，Na+，Mg2+，Zn2+and SO42-，Cl-，NO3-，CO32-，H2PO4-，B4O72-，lemon acid radical，EDTA ion were found having a certain influence to the AMP deaminase.The result showed that lemon acid radical ion and Mn2+had an obviously activated influence on AMP deaminase，but the other ion concentration surpass 0.01mol/L generally had an inhibitory effect on AMP deaminase and the AMP deaminase powder had a good stability quality under atmospheric temperature in dry condition and the half-life of enzyme solution was 5.5 days at 4℃.

AMP deaminase；enzymatic activity；biochemical characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0164-04

2010－11－30 *通訊聯系人

葉煒（1985-），男，碩士在讀，研究方向：生物催化與轉化。

三峽大學2010年研究生創新基金項目（2010CX099）。