華蟾素誘導L1210細胞凋亡及作用機制的研究

劉偉

華蟾素誘導L1210細胞凋亡及作用機制的研究

劉偉①

目的：探討華蟾素對離體小鼠急性淋巴細胞白血病L1210細胞的作用。方法：將L1210細胞分為對照組及藥物處理組。MTT實驗檢測細胞活性及增殖抑制情況；DNA 親和染料Hoechst 33258熒光染色觀察細胞核變化；Western Blot 檢測細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的改變。結果：華蟾素在0.25~1.0 μM濃度范圍內即表現出顯著的細胞生長增殖抑制，而且有時間和濃度依賴性；Hoechst 33258染色發現高濃度的華蟾素作用48 h，L1210細胞即表現出凋亡形態改變；Western Blot實驗表明，細胞凋亡通路相關蛋白Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9表達明顯高于對照組。結論：華蟾素有誘導L1210細胞凋亡的作用。

華蟾素； L1210細胞； 細胞凋亡； Caspase-3

白血病是危害兒童最嚴重、發病率最高的惡性腫瘤。隨著工業的發展，環境污染及工業材料的濫用，兒童白血病發病率逐年上升。目前，對兒童白血病的治療仍缺乏有效的藥物及治療方案。探討新型有效、低度誘導白血病細胞凋亡藥物是當前白血病治療領域的重要任務。中藥素來以低毒優越于西藥，所以，在眾多中藥品種中發現有潛在誘導白血病細胞凋亡、阻滯細胞增殖的藥物應該是正確的方法。

華蟾素是中華大蟾蜍全皮的水溶性制劑，其化學成分復雜，具有低毒、抗癌譜廣的優點。華蟾素制劑已經用于臨床消化系統及婦科腫瘤的輔助治療，增強了化療藥物的藥理作用。華蟾素制劑用于血液系統腫瘤的研究較少，本文以L1210細胞為模型，研究華蟾素對L1210細胞的作用，并探討其分子機制，為臨床治療血液系統腫瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠急性淋巴白血病L1210細胞，購自中國科學院上海生化細胞研究所細胞庫。

1.2 試劑 華蟾素注射液購自深圳市三九醫藥貿易有限公司；MTT及Hoechst33258購自Sigma公司；DMSO購自Amresco；Anti-Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9， β-Actin antibody購 自 Santa Cruz；HRP-Goat anti-rabbit antibody 及ECL化學發光液購自普利萊基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞增殖實驗(MTT) 對數生長期細胞接種于96孔細胞培養板中，接種濃度1×104個/ml。邊緣孔不加，除去邊緣效應。細胞接種24 h后，加入含不同濃度華蟾素的培養液，華蟾素初始濃度100 μmol/L， 依次倍比稀釋至終濃度 0.1 μmol/L，0.25 μmol/L，0.5 μmol/L，1.0 μmol/L，每個濃度無重復；對照組除不加華蟾素外其余均同加藥組；分別培養 12 h， 24 h， 36 h，48 h 后每孔加入 20 μl MTT，37℃繼續孵育4 h，扣板法去除培養液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩10 min直至藍色結晶物完全溶解，立即用全自動酶標儀檢測OD570值。

1.3.2 Hoechst 33258染色觀察L1210細胞凋亡形態學變化對數生長期細胞L1210按1×104個/ml濃度接種于提前用多聚賴氨酸處理的蓋片上。不同濃度的華蟾素處理48 h后，傾去培養液，加入預冷PBS洗滌細胞2次；加入4%多聚甲醛4℃固定5 min；調整Hoechst 33258染液濃度至終濃度5 μg/ml，37 ℃避光染色15 min；棄去染液，在熒光顯微鏡下觀察拍攝。

1.3.3 Western Blot檢測細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的改變 對數生長期細胞接種至100 mm培養皿中，培養過夜后加入不同濃度的華蟾素繼續培養48 h。終止培養，加入冰預冷PBS洗兩次，細胞刮收集細胞。加入細胞裂解液50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.3 mol/L NaCl， 1% NP-40，0.1%去氧膽酸鈉，0.1% SDS， 1 mmol/L EDTA ， 50 mmol/L 氟化鈉，1 mmol/L 偏礬酸鈉；抑肽酶 20 μg/ml， 亮肽酶 10 μl/ml，(均購自 Amresco 公司 )，100 mmol/L PMSF( 購自 Sigma 公司 )。冰浴裂解30 min；16 000 g，4 ℃離心30 min，收集上清并加入loading buffer，震蕩混勻95℃水浴5 min。細胞總蛋白經10 %SDS-PAGE電泳分離后，轉移至PVDF膜；經5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜，PBST洗3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；然后加入ECL化學發光液，X光片暗室曝光、顯影及定影。

2 結果

2.1 華蟾素對L1210細胞增殖的抑制作用 采用MTT法檢測不同濃度華蟾素對L1210細胞增殖抑制作用。從圖1可見，對數生長期L1210細胞加入華蟾素后均有不同程度的增殖抑制作用，隨著華蟾素濃度的增加，L1210細胞增殖抑制作用逐漸增加。而且，當同一華蟾素濃度作用時間逐漸延長時，對L1210抑制作用逐漸增強。

圖1 不同濃度的華蟾素作用不同時間對L1210細胞活力的影響

2.2 華蟾素對L1210細胞誘導凋亡形態學變化 不同濃度華蟾素作用L1210細胞48 h后，細胞經DNA親和染料Hoechst33258染色后發現，華蟾素作用細胞48 h，細胞發生了典型的凋亡形態學改變，表現為細胞皺縮、細胞核凝集、核碎片化(見圖2)。

圖2 華蟾素對L1210細胞形態戀化的影響

2.3 華蟾素誘導L1210細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的改變 不同濃度華蟾素作用L1210細胞48 h后，Western Blot檢測細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的改變。圖3所示，華蟾素能明顯誘導L1210細胞Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9表達增高，提示L1210細胞經華蟾素作用后發生了凋亡。

圖3 華蟾素對細胞凋亡信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論

華蟾素應用于腫瘤治療已有多年的歷史。華蟾素抗腫瘤作用的機制主要有細胞毒性作用，直接作用于細胞DNA[1-2]；啟動細胞免疫機制增強宿主細胞免疫能力及特異性抗原殺傷能力[3-4]；誘導腫瘤細胞凋亡作用[5]；抑制腫瘤細胞血管生成作用[6-7]。華蟾素誘導腫瘤細胞凋亡的作用在肝癌細胞及胃癌細胞中均見報道[8-9]，但具體凋亡發生機制還不清楚。

筆者首先使用不同濃度華蟾素作用L1210細胞不同時間，MTT實驗檢測細胞活性及增殖抑制情況，結果發現細胞活性明顯低于對照組，說明華蟾素具有抑制L1210細胞增殖的作用。多種因素可以使細胞增殖發生抑制，比如細胞毒性、細胞自噬及壞死，細胞周期阻滯及細胞凋亡等。為進一步檢測L1210細胞增殖阻滯的分子機制，筆者首先觀察了細胞形態學改變。細胞形態學變化比較客觀地顯示了細胞經華蟾素作用后發生了凋亡變化。即表現出細胞皺縮、細胞核凝聚、細胞核片段化改變等典型的凋亡形態學改變。Western Blot進一步從蛋白分子水平上表明經華蟾素作用，L1210細胞凋亡通路相關蛋白Caspase-3， Caspase-8， Caspase-9表達水平增高，Caspase 是一個含有半胱氨酸活性的胞質蛋白酶家族，迄今至少發現14 個成員。Caspase-3 是目前發現的細胞凋亡過程中激活的關鍵酶，也是細胞凋亡的主要效應分子[10]，Caspase-3激活后繼續激活一系列凋亡蛋白，使細胞發生不可逆性凋亡。所以這說明，華蟾素作用L1210細胞后細胞發生了凋亡。

發現新型抗癌活性高、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤治療領域的重要任務。本實驗充分證明，華蟾素在低濃度時及能誘導L1210細胞發生Caspase依賴性凋亡，為臨床應用華蟾素治療兒童白血病提供了一定的理論依據。

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10.3969/j.issn.1674-4985.2012.24.008

①河南省新蔡縣人民醫院 河南 新蔡 463500

劉偉

2012-04-05) (本文編輯：車艷)