戊地昔布聯合阿霉素對人乳腺癌細胞增殖的抑制作用及其機制研究Δ

劉煥龍，康寧，李軍霞，陳雪彥，張志清#

（1.河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊0 5 0 0 0 0；2.河北醫科大學藥理教研室，石家莊 0 5 0 0 1 7）

戊地昔布聯合阿霉素對人乳腺癌細胞增殖的抑制作用及其機制研究Δ

劉煥龍1＊，康寧1，李軍霞2，陳雪彥2，張志清1#

（1.河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊0 5 0 0 0 0；2.河北醫科大學藥理教研室，石家莊 0 5 0 0 1 7）

目的：研究戊地昔布聯合阿霉素對人乳腺癌細胞（MCF-7）增殖的抑制作用及其機制。方法：將人MCF-7細胞隨機分為空白對照組、溶劑對照組、阿霉素（0.2 5 mg·L－1）組、戊地昔布（2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）組及聯用組（阿霉素0.2 5 mg·L－1+戊地昔布2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1），加入相應藥物繼續培養，檢測培養2 4、4 8、7 2 h（n＝6）后各組人MCF-7細胞的增殖抑制率；檢測戊地昔布2 5 μmol·L－1時培養4 8 h后各組細胞周期和增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白、細胞周期蛋白（Cyclin D1）及環氧酶2（COX-2）蛋白表達。結果：與溶劑對照組比較，除戊地昔布2 5 μmol·L－1培養2 4 h外，阿霉素組、戊地昔布組及聯用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1），且呈濃度、時間依賴性；與阿霉素組和戊地昔布組比較，聯用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1）。戊地昔布組細胞阻滯于G0/G1期，S期細胞比例明顯減少（P＜0.0 5）；聯用組細胞阻滯于G0/G1期和G2/M期。與溶劑對照組比較，戊地昔布組、阿霉素組及聯用組PCNA、Cyclin D1蛋白表達均明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1），僅戊地昔布組和聯用組COX-2蛋白表達明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1）。結論：戊地昔布與阿霉素聯用具有協同抑制人MCF-7細胞增殖的作用，可能與抑制Cyclin D1和PCNA蛋白表達從而阻滯細胞周期有關。

人乳腺癌細胞；戊地昔布；阿霉素；細胞增殖；細胞周期

乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，其治療方法目前仍以化療為主。經典的化療藥物包括蒽環類抗菌藥物，如阿霉素等，但阿霉素等化療藥物抗腫瘤的同時可誘導腫瘤組織環氧酶2（COX-2）表達，促進腫瘤生長。因此，COX-2抑制劑有望增強阿霉素等藥物的抗腫瘤作用、減輕毒性，此聯合用藥方案可能突破乳腺癌等腫瘤治療的瓶頸。COX-2在腫瘤形成過程中有重要的作用，不僅促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，也促進腫瘤的侵襲和轉移[1]。戊地昔布是第2代選擇性COX-2抑制劑，對COX-2的選擇性高，所致胃腸道等不良反應發生率低。前期研究[2，3]發現，戊地昔布對人胃癌BGC 2 8 2 3細胞生長及Lewis腫瘤有明顯的抑制作用，但其能否抑制乳腺癌細胞增殖、與阿霉素聯用是否有協同作用尚未見報道。因此，本實驗通過觀察戊地昔布聯合阿霉素對人乳腺癌細胞（MCF-7）的增殖抑制作用，并探討其可能的機制，為乳腺癌的臨床治療提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

凝膠成像儀（美國Thermo Forma公司）；Epics-XLⅡ型流式細胞儀（美國Beckman Coulte公司）。

1.2 試藥

戊地昔布原料藥（河北醫科大學藥學院制備，純度：9 9%）；注射用阿霉素滅菌粉末（浙江海正藥業有限公司，批號：1 0 1 0 0 2，規格：每支1 0 mg）；MTT（德國Serva公司）；抗增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗體、COX-2抗體及β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自美國Santa Crutz公司；辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗（美國KPL公司）。

1.3 細胞

人MCF-7細胞株，由河北醫科大學第四醫院科研中心提供。

2 方法

2.1 細胞培養

將人MCF-7細胞置于含1 0%胎牛血清的RPMI 1 6 4 0培養液中，于3 7℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養。0.2 5%的胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞，制備合適密度的細胞懸液，接種于9 6孔板或培養瓶中，待細胞貼壁后，按分組加入相應藥物后繼續培養。

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率

取對數生長期細胞以5×1 04個/孔接種于9 6孔板上，每孔0.2 mL。待細胞貼壁6 h后，輕輕吸去上清液，按空白對照組、溶劑對照組、阿霉素（0.2 5mg·L－1）組、戊地昔布（2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）組及聯用（阿霉素0.2 5mg·L－1+戊地昔布2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）組，加入相應藥物，繼續培養，除空白對照組外其余各組為試驗組。于培養后2 4、4 8、7 2 h（n＝6）每孔分別加入MTT溶液（5 g·L－1）2 0 μL，置培養箱中繼續培養4 h，然后吸棄上清液，加入二甲基亞砜2 0 0μL溶解紫色結晶，室溫震蕩1 0 min，置自動酶標儀上于5 7 0 nm波長下測定各孔吸光度OD值。并通過下列公式計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）＝（空白對照組OD值－試驗組OD值）/空白對照組OD值×1 0 0%。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期變化

取生長良好的細胞以合適密度接種于培養瓶中，待貼壁后隨機分為溶劑對照組、阿霉素組（0.2 5 mg·L－1）、戊地昔布組（2 5 μmol·L－1）及聯用組，加入相應藥物，繼續培養4 8 h，消化，離心，收集細胞于離心管，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次（每次1 0 0 0 r·min－1離心1 0 min），收集并調整細胞為1×1 06個/mL，用7 0%的冷乙醇固定，4℃貯存。染色前用PBS洗去固定液，加1 0 0 μL RNA酶（5 0 mg·L－1），3 7℃水浴3 0 min，再加入4 0 0 μL碘化丙啶（1 0 μg·L－1）染色混勻，4℃避光3 0 min，流式細胞儀檢測。計算機處理并分析細胞增殖周期中G0/G1、S和G2/M期細胞數占總細胞數的百分比。

2.4 Western blot法檢測PCNA、Cyclin D1及COX-2蛋白表達

細胞按“2.3”項下方法分組，各組細胞經藥物處理4 8 h后，收集細胞，PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液，超聲2 min，冰上放置1 h，使細胞充分裂解，采用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。等量蛋白（2 0 μg）上樣，SDS-PAGE電泳，電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（4℃、2 h），室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，加入一抗（PCNA、Cyclin D1、COX-2抗體），4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，每次1 0 min，然后加入相應HRP標記的二抗，3 7℃孵育1 h。TBST洗膜3次，底物顯色。凝膠成像儀照相，以β-actin為對照，測定灰度值，試驗重復3次。

2.5 統計學處理

所有數據均采用SPSS 1 5.0軟件進行數據分析，數據以x±s表示，采用單因素方差分析，Dunnet t檢驗進行組間比較。P＜0.0 5表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞增殖抑制率

空白對照組和溶劑對照組人MCF-7細胞體外生長良好，2組OD值無明顯差異。與溶劑對照組比較，除戊地昔布2 5 μmol·L－1培養2 4 h外，阿霉素組、戊地昔布組及聯用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1），且呈濃度、時間依賴性；與阿霉素組和戊地昔布組比較，聯用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1）。各組人MCF-7細胞的增殖抑制率比較詳見表1。

表1 各組人MCF-7細胞的增殖抑制率比較（n＝6）Tab 1 Comparison of inhibition rates of human MCF-7 cells proliferation in each group（n＝6）

3.2 細胞周期

戊地昔布組作用于人MCF-7細胞可使細胞阻滯于G0/G1期，而S期細胞比例顯著降低（P＜0.0 5），但對G2/M期細胞比例無明顯影響。阿霉素組作用于人MCF-7細胞可使細胞周期阻滯于G2/M期，S期細胞比例也顯著降低（P＜0.0 1），但對G0/G1期細胞比例無明顯影響。聯用組G0/G1期和G2/M期細胞比例與溶劑對照組相比均明顯增加（P＜0.0 1），S期細胞比例顯著降低（P＜0.0 1）。各組人MCF-7細胞周期分布情況見表2。

3.3 PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表達

PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白在溶劑對照組人MCF-7細胞中均高表達。與溶劑對照組比較，戊地昔布組、阿霉素組及聯用組PCNA、Cyclin D1蛋白表達均明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1），僅戊地昔布組和聯用組COX-2蛋白表達明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1）。各組人MCF-7細胞Cyclin D1、PCNA和COX-2蛋白表達情況見圖1，柱狀圖見圖2。

表2 各組人MCF-7細胞周期分布情況（x±s，n＝6）Tab 2 Distribution of cell cycle of human MCF-7 cells in each grou（px±s，n＝6）

圖1 各組人MCF-7細胞PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表達情況Fig 1 Protein expressions of PCNA，Cyclin D1 and COX-2 in human MCF-7cells of each group

圖2 各組人MCF-7細胞PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表達柱狀圖與溶劑對照組比較：＊P＜0.0 5，＊＊P＜0.0 1Fig 2 Histogram of protein expressions of PCNA，Cyclin D1and COX-2in human MCF-7cells of each group vs.solvent control group：＊P＜0.0 5，＊＊P＜0.0 1

4 討論

研究表明，COX-2參與了許多惡性腫瘤包括乳腺癌的發生發展過程，涉及腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移以及血管生成[4]。選擇性COX-2抑制劑可抑制胃腸道、乳腺癌等腫瘤細胞增殖，誘導凋亡。本研究結果表明，戊地昔布可顯著抑制人MCF-7細胞的增殖，且抑制率具有一定的濃度和時間依賴性。不同濃度的戊地昔布和阿霉素聯用具有協同抑制人MCF-7細胞增殖的作用，表明戊地昔布可促進阿霉素的抗腫瘤作用。

腫瘤細胞增殖與細胞周期密切相關，包括G1-S-G2-M 4個時相，其中G1-S和G2-M 2個轉變點是細胞周期啟動的關鍵[5]。調節細胞周期是抗腫瘤治療的新途徑，為進一步探討戊地昔布與阿霉素的協同作用機制，本研究采用流式細胞儀檢測了細胞周期進展。結果表明，戊地昔布單藥作用于人MCF-7細胞可使細胞周期阻滯于G0/G1期，而S期細胞比例顯著減少；阿霉素是細胞周期非特異性藥物，通過將腫瘤細胞阻滯于G2/M期而發揮其直接殺傷作用[6]，本研究結果也證明了這一點；聯用組G0/G1期和G2/M期細胞比例與溶劑對照組相比均明顯增加，S期細胞比例顯著減少，說明兩藥聯用對細胞周期有協同阻滯作用，提示戊地昔布和阿霉素聯用對人MCF-7細胞的增殖抑制作用與抑制細胞周期進展有關。本研究還在基因和蛋白水平上探討了兩藥對PCNA、Cyclin D1、COX-2蛋白表達的影響。PCNA是分子量為3 6 kD的核蛋白，在G1期和S早期誘導合成，對細胞周期調控有重要作用[7]。Cyclin D1作為細胞周期的啟動因子，推動了細胞周期G1期的進程，如抑制Cyclin D1的活性，細胞便無法進入S期[8]。本研究結果表明，戊地昔布和阿霉素單獨用藥均明顯降低人MCF-7細胞PCNA和Cyclin D1的蛋白表達，聯用后抑制蛋白表達作用更為明顯，顯著降低了腫瘤細胞的增殖作用。同時也檢測了戊地昔布對人MCF-7細胞COX-2蛋白表達的變化，結果表明戊地昔布能明顯抑制COX-2蛋白表達，說明其抑制人MCF-7細胞增殖作用可能與抑制COX-2表達、降低前列腺素E2（PGE2）生成有關。

總之，戊地昔布與阿霉素聯用具有協同抑制人MCF-7細胞增殖的作用，可能與抑制Cyclin D1和PCNA蛋白表達從而阻滯細胞周期有關。

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Inhibitory Effects of Valdecoxib Combined with Adriamycin on Proliferation of Human MCF-7 Cells and Its Mechanism

LIU Huan-long，KANG Ning，ZHANG Zhi-qing
（Dept.of Pharmacy，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 0 5 0 0 0 0，China）
LI Jun-xia，CHEN Xue-yan（Pharmacology Teaching and Research Section，Hebei Medical University，Shijiazhuang 0 5 0 0 1 7，China）

OBJECTIVE：To study the inhibition effects of valdecoxib combined with adriamycin on the proliferation of human MCF-7cells and its mechanism.METHODS：Human MCF-7cells were randomly divided into blank control group，solvent control group，adriamycin group（0.2 5mg·L－1），valdecoxib group（2 5，5 0，1 0 0μmol·L－1）and combination group（adriamycin 0.2 5mg·L－1+valdecoxib 2 5，5 0，1 0 0μmol·L－1）.The inhibition rates of human MCF-7cell proliferation were determined 2 4，4 8，7 2h after treated with relevant medicine（n＝6）.Cell cycle，the protein expressions of PCNA，Cyclin D1and COX-2in various groups were detected 4 8h after cultured in valdecoxib 2 5μmol·L－1.RESULTS：Compared with sdvent control group，the inhibition rate of cell proliferation was increased significantly in adriamycin group，valdecoxib group and combination group，except for culture of valdecoxib 2 5μmol·L－1for 2 4h（all P＜0.0 1），in concentration and time-dependant manner； compared with adriamycin group and valdecoxib group，the inhibition rate of cell proliferation was increased significantly in combination group（all P＜0.0 1）.Valdecoxib markedly blocked the MCF-7cell progression by arresting the cells in the G0/G1phase，and the percentage of cells in S phase decreased dramatically（P＜0.0 5）；and valdecoxib combined with adriamycin blocked the MCF-7cell progression by arresting the cells in G0/G1and G2/M phase（P＜0.0 5）.Compared with solvent control group，the protein expressions of PCNA and Cyclin D1in valdecoxib group，adriamycin group and combination group were decreased significantly（P＜0.0 5or P＜0.0 1），while the protein expression of COX-2in valdecoxib group and combination group decreased significantly（P＜0.0 5or P＜0.0 1）.CONCLUSION：Valdecoxib synchronized with adriamycin can inhibit the proliferation of human MCF-7cells significantly，which may be associated with the inhibition of Cyclin D1and PCNA expression and the blockage of cell cycle.

Human MCF-7cells；Valdecoxib；Adriamycin；Cell proliferation；Cell cycle

R9 6 5

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 0 5-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.0 6

Δ河北省2 0 0 9年醫學科學研究重點課題計劃項目（2 0 0 9 0 3 5 8）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：腫瘤藥理學。E-mail：lhlong0 9 0 4@1 6 3.com

#通訊作者：主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學、藥理學和新型藥物制劑。E-mail：zhangzhq@medmail.com.cn

2 0 1 1-0 8-1 5

2 0 1 1-1 0-1 1）