基因組學技術辟克癌新路

文/高妍 李會會

黃健博士

黃健，博士，研究員。多年從事腫瘤基因組學和分子遺傳學研究，曾任職于國家人類基因組南方研究中心、深圳華大基因研究院等單位，2011年6月起擔任生物芯片上海國家工程中心腫瘤基因組學轉化應用研究室主任、上海市疾病與健康基因組學省部共建重點實驗室課題組長。

先后承擔多項國家“863”計劃項目、國家“973”項目、國家自然基金項目、國家博士后資助計劃一等資助項目、上海市科委自然科學基金重點項目、上海市學術技術帶頭人項目、深圳市生物產業高技術產業項目等。相關研究先后發表在《Nature Genetics》《JCI》《PNAS》《Carcinogenesis》《Cancer Research》等十幾家國際雜志上。獲得4項上海市科研成果獎、9項國家授權發明專利，參與編寫專著兩部。

“這是世界上第一次利用新型大規模基因組分析技術研究肝癌轉移問題，所獲結果將為肝癌診斷、預后、治療以及開發新型治療藥物奠定基礎。”

針對我國科學家在肝癌轉移關鍵突變基因研究中取得的最新成果，國際頂尖學術雜志《自然?遺傳學》審稿人及有關專家給出了以上評價。

成果研究報告于2012年8月26日在國際著名雜志《自然?遺傳學》網站上在線發布。報告指出：研究團隊利用DNA測序技術，對比分析了乙肝病毒感染相關的肝癌原發灶和侵犯肝臟門靜脈的轉移灶的全部基因外顯子序列，發現腫瘤細胞中共存在347個突變基因，其中大多數是首次在肝癌樣本中發現，且同時出現在了原發灶和轉移灶上。最終，他們驗證評估出了ARID1A、VCAM1和CDK14三種基因的突變可能與肝癌的發生和轉移密切相關。

這一成果的發布在行業內引起強烈反響。幾經周折，本刊聯系到了研究團隊的領導者之一、生物芯片上海國家工程研究中心腫瘤基因組學轉化應用研究室主任黃健博士，在與他的交流過程中，有幸了解到成果背后的點點滴滴。

向“癌中之王”宣戰

肝細胞癌是原發性肝癌的主要形式，也是世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤之一。據統計，全世界每年新發現肝癌100萬左右，占惡性腫瘤的5%左右，其中有40%以上發生在中國。

肝癌在我國素有“癌中之王”稱號。普查資料表明，我國肝癌的發病率為14.58/10萬～46/10萬。全國死亡原因回顧調查顯示，肝癌在男性中平均死亡率為14.52/10萬，僅次于胃癌和食管癌；女性為5.61/10萬，僅次于胃癌、宮頸癌和食管癌。

近幾十年來，肝癌研究取得了可喜進展，但無論東方還是西方，整個人群的肝癌5年生存率仍只有5%左右，而我國的平均肝癌發病率和死亡率均有明顯上升趨勢。到現在為止，人們對肝癌的發病機制還不甚清楚，特別是對肝癌轉移的分子機制了解甚少。

研討會后，黃健（左四）與桂林醫學院的合作者合影

因此，科研人員針對肝癌的攻堅戰役從未停歇，21世紀的肝癌防治研究更加刻不容緩。這也正是黃健投身肝癌研究的原因之一。“利用先進的科學技術解決我國自己的事情，為最終消滅嚴重危害我國人民身心健康的‘癌中之王’提供理論依據和技術支撐。”黃健說。

2001年，黃健開始在國家人類基因組南方研究中心進行客座研究，之后留在南方研究中心擔任課題組長，直到2009年自上海交通大學博士后出站，才到深圳華大基因研究院擔任健康事業研發部主任。這期間，他一直圍繞腫瘤基因組學和分子遺傳學這一方向開展針對肝癌的研究工作，也就是利用基因芯片和高通量測序技術及生物信息學手段，系統分析腫瘤基因組、轉錄組和甲基化組的變異，進而探討各種變異與臨床特征的關聯性，結合細胞學和動物學技術識別鑒定與腫瘤相關的重要功能基因，深入研究其在腫瘤發生、發展中的分子機制，為腫瘤的臨床診斷提供新的指標，或為最終治愈腫瘤提供潛在的藥物靶點。

黃健介紹，臨床實踐發現，肝癌的轉移發生率較高，甚至早期小肝癌亦可能已有肝外轉移。通常多先有肝內播散，然后出現肝外轉移。肝內直接擴散是指癌細胞通過肝竇或竇旁間隙，直接擴散到肝內其他部位，轉移癌灶呈衛星狀分布，也可遠離原發癌，此種方式轉移最早，也最常見。此外，可侵犯門靜脈并形成門靜脈瘤栓，如瘤栓脫落在肝內，則引起多發性轉移灶；門靜脈主干瘤體阻塞，可引起門靜脈高壓和頑固性腹水，最終引起死亡。

“我們知道，轉移發生率與肝癌的生物學特性密切相關，特別是肝癌細胞內轉移促進基因和轉移抑制基因的平衡失調在肝癌轉移中起到重要作用。因此，利用先進的分析技術，系統研究正常組織、癌組織和轉移組織間基因譜系的差別，就有可能發現與肝癌轉移密切相關的基因和基因變異類型，為臨床診斷和治療提供新的思路。”基于這一認識，在科技部“973”計劃和衛生部中長期科技發展規劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項的支持下，黃健和他的伙伴們開始了這項關于肝癌轉移關鍵基因的探索性研究。

肝癌轉移關鍵基因的發現

關于肝癌轉移關鍵基因的研究始于2010年。兩年里，黃健和研究團隊分工協作、共同努力，攻克了高通量測序技術的理解和應用、海量數據的分析、更大規模樣本量的實驗驗證、肝癌高頻突變基因功能的細胞生物學研究等關鍵環節，最終取得現在的成果。

黃健說，只有身處其中，才能真正懂得這其中飽含的辛苦與酸楚，也只有身處其中，才能體會到這樣一項浩大工程從啟動到實施再到完成整個過程所蘊含的快樂與滿足。

他們收集了10例HBV陽性肝癌患者手術后的癌旁組織、原發癌組織和肝內轉移的門靜脈癌栓，利用基因組學領域內最先進的DNA序列分析技術，對這些樣本進行全外顯子組測序分析，并結合生物信息學技術仔細識別每一例患者的三種樣本間的DNA序列的微小差異，最終發現：腫瘤細胞存在347個突變基因，平均每個腫瘤樣本有30～40個基因突變，其中大多數基因突變是第一次在肝癌樣本中發現，并且在原發灶和轉移灶中同時出現。這說明肝癌的發病和轉移與基因突變密切相關，并且轉移相關基因在原發癌中就已經發生了突變。

隨后他們在更大量的肝癌樣本中對基因突變進行了驗證，并且用RNA干擾技術評估了91個已被證實存在突變的基因對肝癌細胞生長的影響。評估結果顯示：ARID1A、VCAM1和CDK14三種基因的突變可能與肝癌發生、轉移密切相關。

“ARID1A基因突變在多種人類腫瘤中均被發現有突變發生，比如卵巢癌、子宮內膜癌、胃癌、腎癌、膀胱癌等。在我們的這項研究中，ARID1A基因在13%肝癌組織中均發生突變。有同行預測，該基因有可能是繼P53基因之后，又一個腫瘤基礎研究和開發應用的明星分子。VCAM1基因除了突變外，還在多數肝癌樣本中表達下降。而與細胞增殖相關的CDK14基因突變則會增強該基因功能，導致細胞生長加快，促進轉移。”黃健解釋道。

黃健參加學術交流會時發言

這些肝癌轉移關鍵基因的鎖定，為我們提供了可能與中晚期肝癌相關的體細胞突變的圖譜，并為人類發現有關驅動肝癌發生及轉移分子途徑提供了重要的線索，更為未來開發臨床可用的肝癌診斷試劑和新型藥物提供了新的靶點。

回首整個研究過程，黃健說，他們遇到的最大困難就是海量數據的分析，這也是高通量測序技術面臨的最大問題。他介紹，目前國際上常用的高通量測序技術有三種：Illumina公司的Solexa系統、ABI公司的 SOLiD系統和Roche公司的454系統。前兩種所獲得的序列較短，但序列的數量比較多，而454系統雖然序列比較長，但一次實驗所獲得的序列總數較少。

項目啟動之初，他們并不清楚每種平臺的不足，更不了解這些不足會對研究工作的推進帶來哪些影響。“所以我們選擇了Solexa和SOLiD兩種系統平臺同時開展工作。先用Solexa系統進行序列分析，再用SOLiD系統對相同的樣本進行二次分析，最后選擇兩種技術共同檢測到的基因變異位點作為后續深入研究的最終數據集。這樣做能夠盡可能地彌補技術本身的不足，可以最大限度地確保結果的準確性。”347個突變基因就是在這一繁瑣的過程中篩選出來的。

而早在2006年，黃健團隊就曾利用Solexa系統的前身技術，完成了我國首例肝臟轉錄組的測序和分析工作，當時序列的長度是18bp。2010年，團隊又完成了中國首個“百種單基因遺傳病”的高通量測序和數據分析工作。這項研究建立的技術可以一次同時檢測100種單基因遺傳病致病基因的變異譜，不僅能夠發現已知的突變類型，而且可以發現新的基因突變，為產前診斷和遺傳咨詢奠定了很好的基礎。這些經驗都為本次的研究工作順利完成奠定了良好的基礎。

團結奮斗共同成長

任何成果都不是一蹴而就的，它來源于研究者長期的積累與沉淀。而該項目短短兩年時間就取得如此顯著成果，更得益于國內多家優秀科研單位和醫院的共同發力。

這一項目的實施得到了科技部和衛生部的大力支持，由國家人類基因組南方研究中心、生物芯片上海國家工程研究中心、上海伯豪生物技術有限公司參與領導，并聯合了深圳市第三人民醫院、復旦大學附屬中山醫院和無錫市人民醫院等國內多家知名醫院共同完成。

“我們一直認為，醫學研究工作是利用先進的科學技術解決臨床中急需解決的問題，這需要多方的合作。”黃健說，正是各方強烈的合作意愿和共同的研究目標促成了本次的聯合研究機制。

也正是這一合作機制的建立，最大化整合了國內基因組學研究領域的各項優質資源，包括研究人員、研究平臺、研究樣本等，確保甚至加速了各項科研工作的順利開展。

如果說聯合研究機制的推動是成果取得的切實保障，那么黃健等項目領導者在過去研究過程中所積累的豐富經驗，就是成果取得的雄厚基石。

2009年12月，由黃健和導師韓澤廣教授領導的功能基因課題組在國際著名雜志The Journal of Clinical Investgation（《臨床研究雜志》）上發布抑癌基因研究方面的新進展—發現了一個可以抑制肝癌轉移的關鍵基因SCARA5。

黃健介紹，SCARA5基因位于第8號染色體短臂上，之前一直沒有引起注意。課題組利用大規模功能基因組方法篩選，歷經4年，才在幾萬個基因中發現了這個對肝癌轉移有舉足輕重作用的基因SCARA5。

研究發現，正常肝臟中，SCARA5所表達的蛋白質的量很高，但在約80%的肝癌樣本中，幾乎找不到它所表達蛋白的蹤影。他們通過小鼠動物實驗證明了自己研究思路的正確性。

黃健研究團隊

隨后他們在更深入的研究中發現，SCARA5基因的使命實際上是抑制癌基因FAK的活性，不讓它活化。因為活化的FAK，會驅使癌細胞瘋狂擴散，更能夠使正常細胞發生過度增殖。

評審專家認為，這不僅是發現了一個與癌癥相關的重要基因，為肝癌提供了潛在新型診斷和治療方法，還采用了新的研究方法，拓展了研究思路。

另一項研究成果發表于2006年11月，當時黃健已經擔任了國家人類基因組南方研究中心的課題組長。在韓澤廣教授的指導下，發現了可能是非常有效的肝癌治療新靶點—印跡基因DLK1。

研究中，他們對82例肝癌樣本進行了檢測，發現DLK1基因在73.2%的肝癌樣本中表達明顯上升，而在正常健康的肝臟組織中DLK1基因并不表達。

此外，利用免疫組織化學染色技術，檢測另外88例原發性肝癌組織樣本，他們還發現DLK1基因與目前臨床常用的肝癌早期診斷指標甲胎蛋白在病理診斷上能形成互補，聯合檢測DLK1基因和甲胎蛋白可以將肝癌的診斷率提高25%以上，這顯示了DLK1基因可能發展為新的肝癌診斷指標的潛質。

他們還發現，降低DLK1基因表達水平能明顯抑制肝癌細胞的增殖，并通過動物實驗進一步證明了這一重要結論。這些都說明DLK1基因可能是非常有效的肝癌治療新靶點，為開發藥物治療肝癌提供了新的思路。

基因服務健康值得期待

黃健介紹，在過去的一年里，大約每個月都有兩到三個家族全基因組和全外顯子組測序工作被用于疾病的基因變異檢測。

馬里蘭貝塞斯達國家衛生研究所的“不能確診疾病計劃”，已經接待了超過5000次的咨詢、查閱了3000份醫療文件，并對15%的病例進行了基因組學技術診斷。

遺傳學家和兒科醫生Thomas Markello介紹說，他的研究小組已經確證多個疾病的遺傳病因，還有大量的新志愿者需要進行驗證。

英國醫學研究臨床科學中心的分子遺傳學家Tim Aitman說，全基因組測序將直接使患者受益。盡管現在聽起來像奇聞，“但它是不可忽視的，并有可能在未來的5～10年內更加普及。”

在世界的各個角落，基因組學的知識和技術都在迅速的發展和進步，它所表現出的巨大潛能，吸引著世界各地科學家們為相關技術大范圍走進臨床、服務大眾、改善民生而不斷努力。

而我們的科學家，也不曾懈怠。黃健他們正對肝細胞癌進行更深入的研究，比如在國家“863”計劃支持下，針對肝細胞癌的全基因組和全轉錄組序列數據進行整合分析，試圖從一個全新的視角解讀肝癌發生和發展規律；另外，在國家自然基金和上海市科委重點項目資助下，系統研究肝癌的甲基化和羥甲基化譜，并探討兩種譜系的異常對基因表達的影響。“這些都是基于高通量數據的分析，希望最終的研究成果能夠為人們全面認識肝癌，并最終攻克肝癌提供幫助。”在深入開展醫學基礎研究之外，黃健團隊還在積極探索基因組學技術在臨床的轉化應用，比如基于外周血中的核酸（DNA和RNA），利用高通量測序，開發單基因病和染色體病的產前診斷技術，以及腫瘤的早期診斷和轉移復發監測技術，希望能在公共衛生領域解決一些實際問題。此前，惠及廣州地區數萬名育齡婦女的“預防宮頸癌HPV篩查”活動，就采用了他們研發出的一種快速、準確、低價的宮頸癌檢測技術。

克癌路漫漫，信念伴前行，風雨過后終將迎來絢麗的彩虹。在科學家們的努力推動下，基因組學正快速發展，用基因服務健康，這一美好未來值得期待。

黃健（左二）在廣東鶴山址山鎮的“適齡婦女宮頸癌免費篩查項目”培訓現場