響應面法優化連翹葉中連翹苷提取工藝研究

王 杰，韓曉彤，張 薇，李 霞

(湖南農業大學理學院，長沙410128)

連翹(Forsythia suspensa)是木犀科植物連翹屬落葉灌木，性寒、味苦，常以果實入藥，是中藥中最常見的藥材之一，具有清熱解毒、消結散腫、抗菌及抑制真菌等功能，常見的中成藥如雙黃連口服液、銀翹片等制劑均是以連翹果實作為主藥[1]。連翹苷和連翹酯苷是中藥連翹的主要生物活性組分，也是國家藥典所規定的連翹質量控制指標性成分[2](連翹苷含量不少于0.15%)。研究表明，連翹苷和連翹酯苷均具有較好的抗菌和抗病毒作用[3]。

研究顯示，連翹資源在我國非常豐富，且連翹屬植物葉子與果實的成分有較好的一致性，如:連翹葉中連翹苷含量遠高于連翹果實，含量差別超過40倍[4]。對連翹葉及連翹果實的化學成分分析顯示:連翹苷、連翹脂素、齊墩果酸等生物活性成分在葉中含量均高于果實[4]，因此連翹葉具有十分廣泛的藥用價值。目前人們對于連翹的藥用價值主要集中在連翹果上，尚未見關于連翹葉的利用開發，因此對于其研究不僅有利于擴大藥源，而且有利于連翹資源的綜合開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:連翹葉原料購于山西省運城市百葉農特產有限公司。

試劑:連翹苷標準品(中國食品藥品檢定研究院);乙醇、甲醇均為分析純。

儀器:UV－2450型紫外分光光度計(日本島津)、DK－S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 連翹葉中連翹苷的提取方法

稱取2.0 g干燥的連翹葉粉于50 mL圓底燒瓶中，分別用濃度為 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液浸泡半小時后在溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下浸提 1、3、5、7、9、11 min，過濾收集濾液。

1.2.2 連翹苷的檢測方法

以連翹苷為標準品繪制標準曲線，采用紫外分光光度法測定。測定標準曲線方程為:A=0.04754C+0.00386(R2=0.99705，n=5)。式中:A為波長223 nm處的吸光度;C為連翹苷的含量(mg/L)。

1.2.3 單因素試驗

準確移取一定體積按1.2.1法提取的濾液，定容后紫外分光光度法檢測連翹苷含量。研究乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間及提取次數5個因素對連翹苷吸光度的影響，確定各因素的最佳范圍，每個因素重復試驗3次，取平均值。

1.2.4 響應面試驗

基于單因素試驗結果，以Design－Expert軟件(版本:8.0.5b，生產商:Stat－Ease，Inc.)采用四因素三水平的 Box－Behnken Design(BBD)試驗設計[5]，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)的值為自變量，以連翹苷的得率為因變量，研究響應值以及最佳變量的組合[6]。試驗因素水平及編碼見表1。整個試驗設計在中心點共有27次試驗、3個重復，試驗分兩天隨機完成。

表1 響應面試驗因素水平及編碼

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對連翹苷得率的影響

在一定溫度、料液比下提取連翹葉一定時間，考察乙醇濃度對連翹苷得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，連翹苷得率隨之增加。當乙醇濃度到達70%以后，連翹苷得率隨著濃度增加變化不明顯，因此單次提取實驗中乙醇濃度選擇為70%。

圖1 乙醇濃度對連翹苷得率的影響

2.1.2 料液比對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度下提取連翹葉一定時間，考察料液比對連翹苷得率的影響。由圖2可知，隨著料液比的增加，連翹苷得率隨之增加。當乙醇濃度到達1∶12時，連翹苷得率上升趨勢逐漸變緩，結合考慮實際生產的綜合成本及生產效率，單次提取實驗中料液比選1∶12。

圖2 料液比對連翹苷得率的影響

2.1.3 提取溫度對連翹苷得率的影響

在一定乙醇濃度、料液比下提取連翹葉一定時間，考察溫度對連翹苷得率的影響。由圖3可知，隨著溫度的增加，連翹苷得率隨之增加。當溫度到達80℃后，隨著溫度的增加連翹苷得率變化不明顯，所以單次提取實驗中溫度選80℃。

圖3 提取溫度對連翹苷得率的影響

2.1.4 提取時間對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度、料液比下提取連翹葉，考察浸提時間對連翹苷得率的影響。由圖4可知，隨著提取時間的增加，連翹苷得率隨之增加。當提取時間達到2 h后，隨著提取時間的增加連翹苷得率呈現出下降趨勢，這可能是由于時間過長導致連翹苷不穩定，所以單次提取實驗中時間選2 h。

圖4 提取時間對連翹苷得率的影響

2.1.5 提取次數對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度和一定料液比下提取連翹葉一定時間，考察提取次數對連翹苷得率的影響。由表2可知，連續提取4次以后，Abs的值接近于0，因此不再進行第5次提取。用上述方式提取2次時，連翹苷的累積得率達到94.26%，此時隨著提取次數的增加，連翹苷得率受到的影響不大，綜合考慮得率及生產成本，提取次數為2次。

表2 不同提取次數的連翹葉中連翹苷得率

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析方案及試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以Design－Expert軟件，依據BBD的中心組合實驗設計原理，確定了四因素三水平的響應面分析法，提取次數均為兩次。連翹苷的提取結果見表3。

表3 響應面設計和連翹苷得率

2.2.2 多元二次響應面回歸模型的建立與分析

對上述回歸模型進行方差分析，回歸模型的失擬項為0.8347，沒有顯著性差異;p值小于0.0001，表明模型處理間差異極顯著。其R2值為0.9635，表明此模型能解釋96.35%響應值變化，這表明該模型具有良好的相關性?；貧w模型各項的方差分析還表明，各因素料液比的一次項是顯著的，交互項AC、AD、BC、BD，二次項 C2、D2都表現為極高的顯著性，說明該模型的擬合度好。

利用Design Expert軟件，對試驗設計各組合處理得到的連翹苷得率進行二次回歸分析，建立多元響應面回歸模型 y=－0.701－2.400E－003A－0.0406B+0.0339C+0.0240D+1.300E－004AB+7.100E－005AC+6.050E－004AD+3.650E－004BC+3.525E－003BD+1.300E－004CD－4.189E－005A2－5.033E－005B2－2.713E－004C2－0.0294D2。

由回歸方程經處理得到的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間之間的交互作用對連翹苷得率影響的響應面及其等高線如圖6所示。其中料液比和提取溫度的交互作用對連翹苷得率的影響最為顯著，表現為響應面落差較大，乙醇濃度和提取溫度的交互作用次之。其余因素之間的交互作用也表現出較顯著的效果。通過對圖5的分析可以看出，在此4個因素中，料液比對連翹苷得率的影響最為顯著，其余依次為乙醇濃度、提取時間和提取溫度。此外，各交互因素的最佳作用點基本都落在了試驗范圍之內，證明此響應面試驗設計較為合理。

圖5 乙醇濃度、料液比、溫度、時間交互作用對連翹苷得率影響響應面

2.2.3 模型的驗證試驗

通過連翹苷得率的二次多項數學模型解逆矩陣，得出從連翹葉中提取連翹苷的最佳工藝條件參數為:乙醇濃度80%，料液比1∶14，提取溫度83℃，提取時間2 h，在此條件下，連翹苷最高得率預測值0.3960%。為驗證RSA法的可靠性，采用上述最優提取條件進行連翹苷提取試驗，重復3次得到連翹苷得率的平均值為0.3895%，與理論預測值相差不大，因此，采用RSA法優化得到的提取條件準確可靠，具有實用價值。

3 結論

應用響應面設計法優化出連翹葉中連翹苷最佳提取條件為:乙醇濃度為80%，料液比為1∶14，提取溫度為83℃，提取時間為2 h，在此條件下的連翹苷得率預測為0.3895%。

[1]薛愧玲，袁王俊.連翹葉的藥理研究綜述[J].時珍國醫國藥，2009，20(5):1149－1150.

[2]國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部[M].北京:化學工業出版社，2005.117.

[3]牛新華，邱世翠，邸大琳.連翹體外抑菌作用的研究[J].時珍國醫國藥，2002，13(6):342－343.

[4]李發榮，段 飛，楊建雄.中藥連翹及連翹葉中連翹苷含量的比較研究[J].西北植物學報，2004，24(4):725－727.

[5]幕運動.響應面方法及其在食品工業中的應用[J].鄭州工程學院學報，2001，22(3):91－94.

[6]黃家衛，盛振華，余陳歡，等.利用響應面分析法優化金銀花中的綠原酸的超聲提取工藝[J].中國現代應用藥，2010，27(11):995－998.