DW-3000呼吸機所致老年大鼠急性肺損傷模型的建立

劉巖，黃佩佳，劉慶輝，姜學革

解放軍總醫院 南樓呼吸科，北京100853

通氣機相關肺損傷（Ventilator-Associated Lung Injury, VALI）或通氣機所致肺損傷（Ventilator-Induced Lung Injury，VILI）是機械通氣治療常見的并發癥之一，是由于大潮氣量或高氣道壓通氣造成的肺臟局部甚至全身的一種炎癥反應[1-2]。在動物實驗研究中建立較為典型的VILI模型具有重要的意義，對于成年大鼠的VILI 動物模型國內外研究已經較多，但目前為止，對于老年大鼠VILI動物模型研究尚較少[3]。隨實驗動物年齡的逐漸增大，其病理、生理過程與成年大鼠有著明顯的不同，推測老年大鼠VILI動物模型有著自身的特點。本研究通過大潮氣量通氣建立老年大鼠的VILI模型，為進一步的VILI實驗研究提供幫助。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

選取健康老年雄性SD大鼠20只，26月齡，SPF（Specific Pathogen Free，SPF）級，體重（557±23）g。將大鼠隨機分為2組，每組10只。A組為致傷組，大潮氣量通氣（30mL/kg），呼吸頻率20次/min；B 組為對照組，小潮氣量通氣（8mL/kg），呼吸頻率40次/min。氣源為空氣，通氣時間4h。呼吸機采用DW-3000（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司生產）。DW-3000呼吸機是定容型正壓呼吸，以電機為動力，由驅動電路控制，有節律地輸出氣流，經吸氣管進入動物肺內，使肺擴張，以達到氣體交換的目的。

1.2 動物準備

稱取大鼠體重后用10%水合氯醛（0.3g/kg）于腹腔內注射麻醉，將其固定于手術臺，行氣管切開及氣管內插管，給予機械通氣后再行頸動脈插管術，采取動脈血行血氣分析，尾靜脈穿刺維庫溴銨（1mg/kg）靜脈注射維持肌肉松弛。

1.3 標本采集

通氣4h后，頸動脈放血處死大鼠。開胸完整取出肺臟，稱取全肺濕重，取1小塊右肺組織，用10%甲醛固定留作病理學檢查，剩余右肺立即放入凍存管，置-80℃低溫冰箱保存。左肺用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次灌洗量為2.5mL，共灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液（Broncho Alveolar Lavage Fluid，BALF）后進行3000r/min離心20min，取上清于-80℃低溫冰箱凍存。肺組織勻漿液的制備：右肺組織100mg +生理鹽水0.9mL，冰浴下制成10%肺組織勻漿，3000r/min離心20min，取上清于-80℃低溫冰箱凍存。

1.4 觀察指標

測定各組大鼠各時間點（0h、1h、2h、3h、4h）的動脈血氧分壓（PaO2）值，并計算氧合指數（PaO2/FiO2）、肺系數（全肺濕重/體重×100）[4]。BALF中IL-1β、IL-8含量測定采用放射免分析方法。 肺組織勻漿中MDA、T-AOC含量測定采用南京建成生物工程研究所提供的檢測試劑盒。HE染色光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.5 統計學分析

實驗數據使用SPSS 10.0統計軟件行成組t檢驗，所測數據以±s表示。

2 實驗結果

2.1 氧合指數

兩組大鼠PaO2/FiO2在通氣前（0h）無統計學差異（P>0.05）；大潮氣量通氣1h后，A組大鼠PaO2/FiO2與B組比較顯著下降，隨通氣時間的延長，PaO2/FiO2進行性下降（表1）。

2.2 肺系數

A組大鼠肺系數（0.60±0.05）與B組（0.77±0.09）比較升高，且差異具有統計學意義（P<0.01）。

2.3 BALF中IL-1β、IL-8水平

A組大鼠BALF中IL-1β、IL-8水平均較B組升高（表2），且差異有統計學意義。

表2 兩組大鼠BALF中IL-1β、IL-8水平

2.4 肺組織勻漿中MDA、T-AOC水平

A組大鼠肺組織勻漿中MDA水平較B組顯著增加，而T-AOC水平較B組顯著下降（表3）。

表3 兩組大鼠肺組織勻漿中MDA、T-AOC的水平

2.5 肺組織病理學改變

光鏡下A組大鼠肺泡壁明顯充血、增厚，肺泡壁和肺間質內可見大量炎性細胞的浸潤及肺泡結構的破壞。B組大鼠肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及間質內無炎性細胞的浸潤。

表1 兩組大鼠不同時間點的氧合指數（PaO2/FiO2）

3 討論

急性肺損傷（Acute Lung Injury, ALI）和/或急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS）的死亡率高達30%～65%。盡管機械通氣能夠降低ALI/ARDS的死亡率，但同時傳統機械通氣（Conventional Mechanical Ventilation，CMV）能造成肺組織的進一步損傷，從而加重ALI/ARDS，甚至導致多器官功能障礙綜合征（Multiorgan Dysfunction Syndrome，MODS）。CMV可作用于肺泡上皮細胞、血管內皮細胞等多種細胞，引起其結構和超微結構的改變，通過機械轉導機制激活細胞內信號轉導系統，基因表達的變化，導致細胞因子/趨化因子的釋放，使中性粒細胞活化、募集到肺泡腔，從而導致VALI/VILI。VALI/VILI有著較高的死亡率，進一步研究其發生發展機制具有重要的意義[1,5-7]。

目前，ALI/ARDS的診斷仍廣泛沿用1994 年歐美聯席會議提出的診斷標準，PaO2/FiO2是反映急性肺損傷程度的重要指標，診斷急性肺損傷很重要的一條標準是PaO2/FiO2≤300。我們的研究表明，大潮氣量通氣1h后，氧合指數致傷組與對照組比較即開始顯著下降，隨通氣時間的延長，PaO2/FiO2進行性下降。當通氣4h后，PaO2/FiO2<300，達到急性肺損傷的程度。肺系數是反映肺組織水腫程度的一個重要指標[4]。大潮氣量通氣4h后，老年大鼠肺系數致傷組較對照組顯著升高，提示大潮氣量通氣組肺組織有更多水分的潴留，肺組織滲出更為明顯。

在VALI/VILI發生機制中，細胞因子是造成肺損傷的重要因素[6]。IL-1β是炎癥急性反應早期的重要促炎因子，主要來源于單核/巨噬細胞，能促進內皮細胞粘附白細胞，刺激內皮細胞分泌炎癥介質，增加炎性滲出和中性粒細胞溶酶體酶釋放及氧自由基產生，促進單核/巨噬細胞釋放IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子[8]。本研究表明，DW-3000呼吸機大潮氣量通氣4h后，老年大鼠BALF中IL-1β的水平較小潮氣量通氣組顯著增加。另一炎性細胞因子IL-8也平行性增高，提示大潮氣量通氣能夠造成肺組織內炎性細胞因子含量的顯著增高，并能進一步造成肺組織的損傷。MDA是一種脂質過氧化產物，是檢測體內脂質過氧化程度的客觀指標[9]。T-AOC是反映機體抗氧化能力大小的指標[10]。此項研究表明，DW-3000呼吸機大潮氣量通氣4h后，肺組織中MDA含量顯著增加，T-AOC顯著減退，提示氧化應激參與了VILI的發生發展過程。總之，我們的研究表明，DW-3000呼吸機大潮氣量通氣4h后能夠成功復制老年大鼠急性肺損傷的動物模型。

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