復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒的HPLC指紋圖譜研究

王永來 陳紅軍 劉志承 高厚明

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518033）

萎胃顆粒由黃精等中藥材組成，我院臨床用于慢性萎縮性胃炎、療效顯著。原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對萎胃顆粒中的部分中藥材進(jìn)行薄層色譜法鑒別[1]。趙欣[2]用薯蕷皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)建立了黃精的HPLC指紋圖譜。筆者據(jù)此以薯蕷皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)，以黃精藥材為對照，用HPLC法建立復(fù)方黃精制劑——萎胃顆粒指紋圖譜，標(biāo)定14個共有色譜峰，8批萎胃顆粒共有指紋圖譜的相似度均大于0.9，可作為方中黃精藥材和萎胃顆粒的質(zhì)量控制，現(xiàn)在報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日本島津LC-6A高效液相色譜儀，附SPD-6AV可變波長檢測器及數(shù)據(jù)處理軟件等系統(tǒng)等儀器。

1.2 試藥

薯蕷皂苷元（1 1 1 5 3 9-2 0 1 0 0 9），黃精對照藥材（121341-201010），以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。萎胃顆粒（本院制劑室研制產(chǎn)品），試劑均為色譜純或分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18，(250mm×4.6mm，5μm)柱，流動相：乙腈（A）：水（B），二元梯度洗脫（V/V），梯度程序0～10min，5%～10%A；10～30min，10%～35%A；30～40min，35%～60%A；40～60min，60%～100%A。流速：1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長：200nm，進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對照品和供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取薯蕷皂苷元適量，加甲醇溶解并配成113.9mg/L的對照品溶液。0.45μm濾膜過濾，置冰箱備用。另外精密稱取干燥恒重的黃精藥材對照品（干粉）2.0g，加70%乙醇40mL，超聲處理40min放冷，0.45μm濾膜過濾，濾渣再加70%乙醇40mL，再超聲處理，合并2次提取液、加10mL甲醇定容，作為黃精對照藥材溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取我院制劑復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒0.25g（相當(dāng)于黃精干粉2.0g），按照“2.2.1”項(xiàng)下的黃精藥材溶液一樣操作，最后取其濾液作為萎胃顆粒的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒201010樣品0.25g，分別精密稱取6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，以13號峰薯蕷皂苷元為參照峰，計(jì)算出1～14號共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD為0.025%～1.568%，同時用相似度評價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度均＞0.99，表明本法重復(fù)性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一樣品（復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒201010）供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，以13號峰薯蕷皂苷元為參照峰，計(jì)算出1～14號共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜1.5%。表明本法和儀器的精密度均良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將上述重復(fù)性試驗(yàn)的201010復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒的供試品溶液，分別在0、4、8、12、24h進(jìn)樣測定，以13號峰薯蕷皂苷元為參照峰，計(jì)算出1～14號共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜2.0%，表明在日內(nèi)和隔日（24h）均穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，黃精藥材對照品溶液和按“2.2.2”制備的8批復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒供試品溶液各20μl，按“2.1”色譜條件分別測定，得各種HPLC指紋圖譜，通過標(biāo)準(zhǔn)品的對照比較，確認(rèn)13號峰為薯蕷皂苷元，但與14號峰基線粘連分離不清，12號峰分離良好，峰面積適中，故選擇為參照峰。將8批復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒指紋圖譜導(dǎo)入藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（A版），進(jìn)行色譜匹配，并用黃精藥材對照品加于比較，匹配結(jié)果見圖1，這就作為復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒產(chǎn)品質(zhì)量HPLC指紋圖譜評定的依據(jù)。

圖1 復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒HPLC指紋圖譜

以12號峰為參照，除去復(fù)方其他藥材及溶劑峰后確定14個共有峰為復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒指紋圖譜的特征峰，各樣品共有峰的相對保留時間（平均值）依次為峰1為0.167、峰2為0.401、峰3為0.416、峰4為0.485、峰5為0.601、峰6為0.655、峰7為0.701、峰8為0.831、峰9為0.866、峰10為0.947、峰11為0.967、峰12為1.000、峰13為1.104、峰14為1.111；把各樣品的峰面積全部標(biāo)定并計(jì)算（取平均值），各共有峰面積依次為①0.051、②0.038、③0.061、④0.088、⑤0.098、⑥0.211、⑦0.112、⑧0.082、⑨0.096、⑩0.031、⑾0.085、⑿1.000、⒀0.098、⒁1.701。采用藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件計(jì)算結(jié)果：這8批復(fù)方黃精制劑萎胃顆粒與對照品指紋圖譜相似度分別為S10.986、S20.981、S30.984、S40.988、S50.981、S60.989、S70.988、S80.987。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)筆者對流動相系統(tǒng)，檢測波長及提取溶劑進(jìn)行篩選研究，最終選用乙腈-水梯度洗脫，14個共有峰分離良好：采用SPD-6AV可變波長檢測器在200nm處的峰信號強(qiáng)出峰多，特征峰干擾少，分離度好：實(shí)驗(yàn)曾用甲醇超聲洗脫或回流提取，但回流加熱破壞了黃精中的有效成份，甲醇超聲提取法所得供試液圖譜出峰多。主要特征峰強(qiáng)、分離度最佳。上述黃精藥材和復(fù)方黃精制劑（萎胃顆粒）HPLC指紋圖譜測定方法經(jīng)過方法學(xué)考察，14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性均好，其RSD均＜2.0%，各色譜指紋圖譜的相似度均＞0.9，能滿足其指紋圖譜測定要求[3]。

以黃精藥材有效成份薯蕷皂苷元為參照峰標(biāo)定了萎胃顆粒的14個共有峰，通過藥典委員會推薦的相似度計(jì)算軟件計(jì)算得到8批萎胃顆粒HPLC指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度均＞0.9。這表明含有黃精藥材的萎胃顆粒其選用黃精藥材和萎胃顆粒的制備工藝穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)建立的萎胃顆粒HPLC指紋圖譜可以作為萎胃顆粒中黃精藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制。這比以前常用的薄層色譜法先進(jìn)、科學(xué)，能較全面控制其產(chǎn)品質(zhì)量[1]。

看來，建立中藥指紋圖譜質(zhì)量控制體系是中藥材、半成品和成品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展方向[3]，將生物指紋技術(shù)配合主要藥效成分的測定用于中藥質(zhì)量控制是目前較為合理的方法[4]。

[1]熊明玲,劉紀(jì)青,張尚斌.淺談萎胃顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2006,21(1):22-23.

[2]趙欣,劉曉蕾,蘭曉繼.黃精的高效液相色譜指紋圖譜[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,20(2):114-119.

[3]劉文,蔣世云.中藥指紋圖譜研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥房,2011,22(19):1819-1822.

[4]Adahchour M,Beens J,Beinkman UAT.Recent developments in the application of comprehensive two-dimensional gas chromatography[J].J Chromatogr A,2008,1186(1/2):67.