新疆和田地區維吾爾族帕金森病LRRK2基因S1647T多態性分析

閆薈如 馬青平 楊新玲 李紅娟 (新疆醫科大學第一附屬醫院神經醫學中心，新疆 烏魯木齊 830054)

帕金森病(PD)是一種常見于中老年的神經系統變性疾病，各研究表明遺傳因素在PD的病因中起著重要作用，其中LRRK2是重要的易感基因之一。目前已證實LRRK2基因約有20多個突變位點與PD相關，突變類型具有明顯的區域和種族差異性。目前尚未見國外學者對S1647T多態的研究報道，我國大陸的Zheng等〔1〕和臺灣的 Lin等〔2〕研究發現該多態與中國漢族人群PD的發生有關。本研究選擇新疆和田地區維族帕金森患者及健康對照者為研究對象，觀察LRRK2基因多態位點S1647T與新疆和田地區維族帕金森病的關系。

1 對象與方法

1.1 診斷標準 病例組為在流調基礎上得到的PD患者(均為散發性)，對照組為從調查地點選擇的生活背景與PD患者相似，年齡、性別、族別等相互匹配，并且經嚴格檢查確定無血緣關系的健康非PD者。以英國BrainBank診斷標準進行篩查，部分診斷困難者再由神經內科資深專家進行審核確診，必要時行頭顱核磁或CT證實。發病年齡以50歲為界分為早發PD組和遲發PD組。排除繼發性PD和帕金森疊加綜合征以及神經系統其他疾病、甲狀腺功能亢進、遺傳病等。

1.2 一般資料 病例組124例，男72例，女52例，發病年齡31～95(62.7±12.6)歲;對照組130名，男76例，女54例，年齡33～90(60.9±11.6)歲。病例組與對照組的性別構成、年齡間差異均無統計學意義(χ2性別 =0.004，P＞0.05;t年齡 =1.138，P ＞0.05)。

1.3 方法

1.3.1 DNA制備 所有患者及正常對照者都經知情同意。取外周肘靜脈血2 ml按常規酚/氯仿法抽提基因組DNA，檢測DNA 純度在1.7～1.9，濃度≥10 ng/μl，－20℃保存。

1.3.2 引物的設計 根據National Center for Biotechnology Information(NCBI)及ensembl中的DNA序列庫中LRRK2基因S1647T所在的Exon34的DNA序列，設計S1647T引物序列，上游：5'-CTTCTAGGCCACATGGTTG-3';下 游：5'-TCCTATTGGCAAAGCAATCT-3'，擴增片斷長度為326 bp，引物由北京華大生物公司合成。

1.3.3 擴增LRRK2基因第34號外顯子 PCR總體積為25 μl。100 ng/μl上下游引物各為 0.5 μl，MIX10 μl，50 ng/μl gDNA 3.0 μl，ddH2O 11 μl。PCR 反應條件為：S1647T 反應條件：94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，57.8℃退火 30 s，72℃延伸20 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.4 PCR擴增產物檢測與基因型鑒定 取7 μl PCR產物，加入上樣緩沖液(2×溴芬蘭)混勻后，上樣于2%瓊脂糖凝膠，核酸染料染色，D50 Marker做標準對照，4 V/cm電壓電泳，紫外儀上觀察，拍照。擴增片段長度為326 bp。

1.3.5 DNA測序法基因型分析 TT型為純合子(野生型);TA型為雜合子突變;AA型為純合子突變。

1.4 統計學方法 使用 SPSS17.0軟件進行分析?；蛐皖l率及等位基因頻率采用基因計數法，計數資料以率(%)表示，兩組間等位基因頻率和基因型頻率分布的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗 病例組與對照組兩個多態性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，吻合度良好(PD 組 χ2=0.080，P ＞0.05，對照組 χ2=0.410，P ＞0.05)。

2.2 LRRK2基因S1647T位點多態性測序結果 見圖1。

圖1 LRRK2基因S1647T多態位點測序圖

2.3 PD組與對照組S1647T多態基因型頻率和等位基因頻率比較 PD組和對照組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統計學意義(χ2=0.98，P=0.613 和 χ2=0.218，P=0.64)。見表1。

表1 PD組與對照組S1647T多態基因型頻率和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.4 不同年齡PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較 早發PD組與≤50歲對照組(χ2=0.953，P=0.621和χ2=0.584，P=0.445)，遲發 PD組與 ＞50歲對照組(χ2=0.384，P=0.825 和 χ2=0.019，P=0.891)之間基因型頻率和等位基因頻率比較差異無統計學意義。見表2。

表2 不同年齡PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較〔n(%)〕

2.5 不同性別PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較 男性PD組與男性對照組(χ2=0.416，P=0.812和χ2=0.213，P=0.644)，女性PD組與女性對照組(χ2=0.726，P=0.696 和 χ2=0.033，P=0.857)基因型頻率和等位基因頻率比較差異均無統計學意義。見表3。

表3 不同性別PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較〔n(%)〕

3 討論

近年來，隨著諸多PD相關易感基因的發現，人們意識到遺傳因素對PD發病所起的重要作用。LRRK2基因又名PARK8，位于染色體12q2，全長7 584個堿基，有51個外顯子，是常染色體顯性遺傳PD中突變頻率最高的致病基因，也是最常見的遲發型PD的致病基因。

LRRK2基因突變具有明顯的地域和種族差異：G2019S和R1441C在歐洲和北非高加索人群中常見〔3～5〕，在亞洲的突變卻非常少見，僅占LRRK2突變的0.1%左右。G2385R被報道是第一個中國人群特異的PD風險因子，由臺灣的Mata等〔6〕首次發現，隨后其突變研究成為熱點。G2385R在馬來人PD患者中突變頻率為2.0%，但同PD發病無相關性，在印度及高加索等其他種族中均未檢出這個多態〔7～9〕，然而在東亞各國家和地區的散發性PD患者常見該位點突變，突變頻率分別為中國大陸10%，新加坡7.27%，日本11.6%，臺灣8%〔10〕。R1628P是新近發現的一個突變位點，與G2385R類似，其攜帶者以雜合狀態為主，是散發性 PD 的一個風險因素〔11〕。Ross等〔12〕報道R1628P可能是第二個中國人群特異的 PD風險因子，與G2385R不同的是，在亞洲其他種族中未發現該位點突變，是漢族人群特異性的突變位點。

S1647T是除G2385R和R1628P之外又一與中國漢族PD發生有關的多態位點。Zheng等〔1〕研究發現該位點的A等位基因增加了中國華南地區漢族人群PD的患病風險;臺灣的Lin等〔2〕研究證實S1647T多態協同環境因素致使人群的PD患病增加;同時Chang等〔13〕研究結果也表明S1647T位點的突變增加了中國漢族人群PD的發病風險。目前尚未見國外學者對該位點的研究報道。

本研究結果顯示，LRRK2基因S1647T多態以TT和TA基因型多見，AA基因型較少見。A等位基因頻率在PD組與對照組之間無明顯差異，提示A等位基因可能與新疆和田地區維族人群散發性PD遺傳風險可能無關，這與國內Zheng等和Chang等文獻報道的結論不同，由于LRRK2基因突變類型存在明顯的種族及地域差異，新疆地區地處中亞，維吾爾族具有與漢族不同的遺傳背景，所選維吾爾族研究對象均為當地居民，同內地其他地區、民族未有通婚，研究對象同質性較高，該研究結果進一步證實了LRRK2基因突變的地域和種族差異性，說明S1647T是中國漢族人群的突變熱點。按年齡分組，該研究表明S1647T位點基因型頻率及等位基因頻率在早發PD組和≤50歲對照組、遲發PD組和＞50歲對照組、早發PD組和遲發PD組間均無統計學意義。這與Chang等〔13〕研究證明的與早發型PD有關結論不同，這與樣本量不足、抽樣誤差以及Chang的研究對象主要來自四川有關，不同地區、種族、環境及生活習俗的差異也會造成的不同的結果。今后有必要繼續擴大樣本量在其他人群和民族中對該位點進行更進一步的研究。

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