ApoE基因多態性與脂質代謝的相關性

劉金鳳 馬洪勝 李 峰 (濰坊市人民醫院，山東 濰坊 261599)

冠心病 (CHD)的發生是遺傳與環境共同作用的結果。高脂血癥是CHD的主要危險因素之一。近年研究表明，ApoE基因多態性與血脂水平存在相關性，與動脈粥樣硬化程度及CHD的發生密切相關〔1〕。本研究選擇濰坊地區漢族人88例CHD患者與75例健康對照者為研究對象，用限制性片段長度多態性 (PCR-RFLP)方法檢測ApoE常見基因型及在人群中的分布頻率，從分子水平探討ApoE基因遺傳多態性與脂質代謝的關系，為脂質代謝紊亂的防治以及CHD的預防和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 CHD組88例，按WHO1979年制定的診斷標準確診為CHD，均來自我院老年病科與心血管內科門診和病房的濰坊地區漢族人，其中男性56例，女性32例，平均年齡 (56.7±8.1)歲，均排除家族性高膽固醇血癥、脂肪肝、糖尿病、甲狀腺疾病、腎臟疾病、嚴重高血壓和肝臟疾病;對照組75例，為我院體檢健康成人，其中男48例，女27例，其平均年齡 (56.2±9.7)歲。

1.2 標本采集及檢測

1.2.1 標本采集 抽取空腹12～14 h肘靜脈血4 ml分裝，其中3 ml于普通抗凝試管中分離血清，3 h內送檢血脂，余1 ml置0.5%EDTA抗凝管中－20℃冷藏保存同批待測基因型。

1.2.2 PCR及主要試劑 所使用的ApoE的基因位點引物按Tasi等〔2〕報道設計并使用由上海生物工程技術服務有限公司提供的合成引物一對。引物序列為：上游引物5'-ACAGAATTCGC CCCGGCCTGGTACAC-3'，下游引物：5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGGA-3'。

1.2.3 目的DNA片段的PCR擴增及PCR產物檢測 參照改良HixsonJE法進行PCR擴增〔3〕;硝酸銀 (0.1%)染色檢測ApoE基因PCR產物 (244 bp);限制性內切酶 (HhaI)酶切：反應在25 μl體系中進行，其中包括PCR產物19 μl，限制性內切 酶 HhaI 11 μl(10 U/μl，Sangon 公 司)，10 × buffer 2.5 μl，混勻后置37℃水浴，消化4 h后，置于－20℃終止酶切;聚丙烯酰胺凝膠電泳分型;利用AU600 Olympus全自動生化分析儀上進行六項血脂測定。

2 結果

2.1 CHD組和對照組ApoE基因型及等位基因比較 見表1。CHD組患者中 ApoE基因型依次為 E3/3＞E2/3＞E2/4＞E3/4＞E4/4;對照組ApoE基因型分布依次為E3/3＞E3/4＞E2/3，未檢測出E2/4和E4/4型。兩組中均以E3/3基因型組最常見，兩組均未檢測出E2/2基因型。CHD組中ApoE等位基因頻率依次為ε3＞ε4＞ε2，對照組ApoE等位基因頻率為ε3 ＞ ε2 ＞ ε4。

2.2 不同基因型的CHD患者血脂脂蛋白水平比較 見表2。不同基因型的CHD患者TC、LDL-C、HDL-C、ApoB水平均存在差異，E4/3、E4/4型個體TC、LDL-C最高，與E3/3、E2/3、E2/4型比較差異顯著 (P＜0.01，P＜0.05)，E2/3型個體TC、LDL-C水平最低，與 E3/3、E2/4型比較差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。E3/4、E4/4型個體HDL-C水平顯著低于E2/3組 (P＜0.05)。E3/4、E4/4型個體 ApoB水平顯著高于E3/3、E2/3組 (P＜0.01)。TG、ApoA1水平各基因型組無差異 (P＞0.05)。

2.3 不同基因型的對照組血脂脂蛋白水平比較 見表2。不同基因型的對照組TC、ApoB水平存在差異，TC水平E3/4型顯著高于E3/3、E2/3型 (P＜0.01);ApoB水平E3/4顯著高于E3/3(P＜0.05)，其余各項指標各基因型組無差異 (P＞0.05)。

表1 CHD組和對照組ApoE基因型及等位基因比較〔n(%)〕

表2 不同基因型的CHD、對照組患者血脂脂蛋白水平比較( s，mmol/L)

表2 不同基因型的CHD、對照組患者血脂脂蛋白水平比較( s，mmol/L)

與 E3/3比較：1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

E基因型 CHD組TC TG HDL-C LDL-C ApoA1 ApoB E3/4和E4/45.74±0.781)2.12±0.61 0.89±0.35 3.88±0.722)1.22±0.28 1.15±0.181)5.52±0.671)1.46±0.61 1.17±0.51 3.54±0.75 1.24±0.36 0.97±0.171)TC TG HDL-C LDL-C ApoA1 ApoB 對照組E3/3 5.13±0.45 1.94±0.73 0.96±0.25 3.49±0.84 1.25±0.36 0.97±0.23 5.11±0.52 1.20±0.47 1.34±0.22 3.21±0.67 1.25±0.18 0.86±0.13 E2/3 4.85±0.542)2.03±0.88 1.17±0.252)2.87±0.661)1.18±0.29 0.83±0.141)4.82±0.71 1.02±0.42 1.47±0.25 2.78±0.54 1.23±0.61 0.79±0.18 E2/4 5.22±0.72 1.92±0.76 1.12±0.39 3.11±0.47 3.11±0.47 1.08±0.231)－ － － － － －

3 討論

高脂血癥是CHD和動脈粥樣硬化(AS)的主要危險因素。研究表明，載脂蛋白與機體脂質和脂蛋白代謝存在相關性，迄今發現的載脂蛋白有近20種，而以ApoE基因多態性與高脂血癥及CHD的關系最為密切。

研究表明：正常人群中6種ApoE表型或基因型分布不均勻，但有其共同特點：在一般人群中ApoE3/3分布頻率最高，發生頻率大多超過60%，含ApoE3的雜合子(E3/4，E2/3)居中，約占30%，ApoE2/2，ApoE4/4和ApoE2/4發生頻率最低，三者之和一般不超過10%〔5〕。ApoE基因頻率不存在性別差異，但存在種族差異〔6〕。亞洲人群中ε4等位基因頻率較低(日本0.06，新加坡0.096)〔1〕，本研究顯示，E2/4 型個體所占比例較高，與以往國內外研究報告不同。對照組ApoE等位基因頻率與上述研究結果基本一致，支持亞洲人群中ε4等位基因的頻率較歐美人種低的論點。而在冠心病人群中ε4等位基因的頻率明顯高于健康組，ε2頻率則相反，提示 ApoE ε2、ε4等位基因可能是CHD的遺傳易感基因。

ApoE基因是決定血膽固醇水平的最重要的遺傳因素之一〔6〕。膽固醇變異的14% ～16%歸因于ApoE基因多態性〔7〕，ε4等位基因與高水平的TC、LDL-C、ApoB和低ApoE水平顯著相關，而ε2等位基因的作用恰恰相反，ε2人群往往血清 TC、LDL-C水平最低，ε4人群血清TC、LDL-C水平最高，ε3人群位于二者之間〔8〕。此結論表明ApoE基因型影響個體間血漿TC的作用不受環境和其他遺傳背景的干擾。本研究認為，ApoE4則為高膽固醇血癥的易感因子。ApoE基因多態性與血漿HDLC的關系各家研究結論不一。Eggertsen等〔9〕研究認為，ApoE基因多態性與HDL-C無相關性，我們發現ApoE基因與HDL-C水平關系呈現 E3/4、E4/4、E3/3、E2/4、E2/3 型依次遞增的趨勢。

ApoE基因多態性對血漿TG水平的影響各方研究結論不一〔7〕。一般認為，在整個人群中E2/2、E4/4、E2/4者的血漿TG明顯高于E 3/3者，提示ε2、ε4等位基因均與血漿高TG濃度有關。但朱鐵兵等〔10〕研究結論與之相左，認為ε4對TG并無明顯影響。我們研究發現無論CHD患者還是健康人，TG水平各基因型組無差異。

ApoE基因對載脂蛋白也有重要影響。普遍研究認為，ApoB變異的12%可以由ApoE基因多態性解釋，ApoA1的變化與ApoE基因型的關系依下列順序遞降：E2/2＞E2/3＞E2/4＞E3/3＞E3/4＞E4/4。本研究發現，無論CHD患者還是健康人，不同基因型組個體ApoA1水平并無顯著差異，而攜帶ε4等位基因個體ApoB水平顯著高于ε2、ε3等位基因個體。

ApoE基因引起血脂差異的機制尚不十分清楚，研究認為可能與各種ApoE受體結合能力強弱、影響含ApoE的脂蛋白代謝速度有關。ApoE主要在乳糜微粒(CM)中起重要作用。這有助于將外周的膽固醇運送到肝臟經過代謝排出。研究發現，ApoE的異構體與LDL受體的結合能力不同，與野生型ε3相比(即以野生ApoE為100%)，ε2為＜2%，即幾乎沒有與LDL受體結合的能力，從而導致富含TG的脂蛋白分解較慢，CM殘體清除減慢，使血中的TG升高;而由ApoE介導的LDL轉化為LDL的速度減慢，細胞LDL受體上調造成的LDL外周分解代謝加快以及由LDL受體介導的肝細胞內吞LDL速度加快，使得ApoE2等位基因攜帶者的TC及LDL水平下降〔11〕。而ApoE4與LDL受體的結合能力則為23%。由于ApoE2與受體的結合能力低以及肝臟攝取處理CM微粒、VLDL殘粒發生障礙，血中的VLDL富含TG，表現為高甘油三酯血癥：另一方面，肝臟中的膽固醇相對較少，LDL受體上調，肝臟攝取血循環中的LDL較低，由于總膽固醇主要取決于LDL水平，所以ApoE2等位基因攜帶者往往表現為低總膽固醇和低LDL。而關于不同的ApoE異構體影響血脂調節功能的機制，主要是由于ApoE在發生氨基酸取代后，改變了受體結合區域的電荷，從而影響受體的結合能力所致〔12〕。

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