丹皮酚對高血壓患者血管內皮細胞Toll樣受體4、核因子-κB表達的影響

張競之 陳小憶 金偉孝 李華鋒 區鴻斌 (廣州醫學院第二附屬醫院中醫科，廣東 廣州 510620)

高血壓(EH)是一種與多因素有關的疾病，其發病機制尚未完全明確。研究表明，血管內皮損傷在原發性高血壓的發生發展過程中起重要作用，EH患者的內皮功能均存在不同程度的損傷〔1〕。本研究從Toll樣受體信號途徑(TLR-NF-κB)入手，通過觀察丹皮酚對EH患者血清損傷的血管內皮細胞Toll樣受體(TLR4)、核轉錄因子(NF-κB)表達的影響，從炎癥免疫的角度面探討其保護EH血管內皮細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 病例選擇與分組 所選患者均為2007年3月至2008年6月在暨南大學附屬第一醫院符合世界衛生組織/國際高血壓學會統一診斷標準的2、3級EH確診者。其中，EH組40例，男23例，女17例，年齡50～70歲，平均(65.23±8.46)歲，平均收縮壓(168.63±14.45)mmHg，平均舒張壓(105.93±8.27)mmHg，入選患者均排除糖尿病、心、腦、腎等靶器官損害及并發癥，檢查前1 w未服用影響血壓的藥物。健康組30例，為暨南大學醫學院中醫系研究生健康志愿者，血壓均在正常范圍，與EH患者血壓比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。

1.2 血清收集 患者組及健康對照組均空腹抽血，采血前患者均未使用任何藥物，無菌采集前臂靜脈血，置入無菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后4℃，2 000 r/min離心15 min，取上清液置無菌EP管，恒溫水浴箱56℃滅活30 min，－20℃凍存，備用。

1.3 細胞與主要試劑 人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-C購自武漢“中國典型培養物保藏中心”。DMEM培養基、南美胎牛血清購自Gibco公司。TaKaRa SYBRR ExScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。熒光定量PCR特異性引物由上海英駿生物技術有限公司合成。蛋白Marker購自Invitrogen公司。H-TLR-4一抗購自Santa公司。H-NF-κBa一抗購自 CST公司。二抗購自Cell Signal公司。ECL發光試劑盒購自Cell Signal公司。PVDF膜購自Axygen公司。丹皮酚購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110708-200505。脂多糖(LPS)系北京普博欣生物技術有限公司生產。

1.4 細胞培養與條件培養基配制 人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-C培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，隔天換液，0.25%胰酶消化傳代。丹皮酚母液的配制：20 mg丹皮酚溶于2 ml DMEM中，使其溶濃度為10 g/L，4℃避光保存。LPS母液的配制：1 mg LPS溶于1 ml DMEM中，使其溶濃度為1 g/L，4℃避光保存。條件培養基按實驗設計如下配制：EH組：10%EH患者血清 +90%DMEM;健康組：10%健康人血清 +90%DMEM;LPS 誘導組：8 990 μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +10 μl LPS 母液;丹 皮 酚小 劑量 (100 μg/ml)組：8 890 μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +100 μl丹皮酚母液 +10 μl LPS母液;丹皮酚中劑量(200 μg/ml)組：8 790 μl DMEM+1 000 μl健康人血清+200 μl丹皮酚母液+10 μl LPS母液;丹皮酚大劑量(320 μg/ml)組：8 590μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +400 μl丹皮酚母液 +10 μl LPS 母液。

1.5 Real-time PCR法檢測TLR4 mRNA的表達 EH組、健康人組、不同濃度丹皮酚組細胞在37℃、5%CO2條件下培養24 h后(檢測NF-κB時培養2 h)，采用Trizol法提取各樣品總RNA，測定純度并定量后參照試劑盒使用說明書合成第一鏈cDNA，于PTC-200型梯度PCR儀上42℃反應15 min，95℃反應2 min。取2 μl cDNA樣本按照10倍梯度稀釋，依次稀釋成共6個濃度梯度的cDNA，制備成陽性定量標準品梯度，倍比稀釋一定要準確。每次上機必須新鮮配制陽性定量標準品梯度，正式上機時以包含所有樣本的梯度上機進行Real-time PCR反應。目的基因TLR4正義鏈引物：5'-TGC AAT GGA TCA AGG ACC AG-3'，反義鏈引物：5'-TGA GGA CCG ACA CAC CAA TG-3'(147 bp)。目的基因IκBa正義鏈引物：5'-CCT GCA CTT GGC CAT CAT C-3'，反義鏈引物：5'-TGC TGC AGG TTG TTC TGG AA-3'(105 bp)。內參 β-actin正義鏈引物：5'-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3'，反義鏈引物：5'-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3'(106 bp)。反應條件為：95℃ 5 s，然后60℃ 20 s，共40循環。反應結束后，由電腦自動生成熒光擴增曲線、標準曲線以及溶解曲線。使用最大二階倒數法進行分析。

1.6 Western印跡法檢測TLR4、IκBa蛋白的表達 各組細胞在37℃、5%CO2條件下培養(檢測TLR4時，細胞培養24 h，檢測IκBa時，細胞培養1 h)，用細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白樣品煮沸變性后，SDS-PAGE電泳，隨后電轉移至硝酸纖維素膜上，將膜用雙蒸水漂洗后放入含有封閉液的容器中，室溫下脫色搖床上4℃振蕩過夜。加入用TBS/T稀釋至適當濃度的一抗，4℃振蕩過夜。TBS/T洗膜。加入封閉液稀釋的二抗，4℃振蕩過夜，TBS/T洗膜。將膜與ECL反應5 min后，曝光、顯影、定影、分析。

1.7 統計學處理 采用 SPSS16.0統計軟件包，計量數據以s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1 EH患者和健康人血清處理對TLR4基因表達的影響HUEVC-C用EH患者血清和健康人血清分別培養24 h后，TLR4基因在EH患者組的表達明顯高于健康組〔(8.259 8±0.268 5)×10－4vs(5.416 0 ±0.248 8)×10－4，P ＜0.01〕，說明EH患者組較健康組存在著嚴重的炎癥反應和免疫紊亂。

2.2 丹皮酚對細胞TLR4 mRNA表達的影響 見表1。丹皮酚對LPS引起的TLR4高表達有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性地阻斷這種反應(P＜0.01，P＜0.001)，說明丹皮酚可作為TLR4活化抑制劑，調控了細胞內TLR4的表達。

表1 丹皮酚對細胞TLR4 mRNA，IκBa mRNA表達的比較( s，n=30)

表1 丹皮酚對細胞TLR4 mRNA，IκBa mRNA表達的比較( s，n=30)

與LPS誘導組比較：1)P ＜0.01，2)P ＜0.001

97.356 9±0.959 9 0.066 5±0.000 7丹皮酚小劑量組 10.706 5±0.665 71) 0.097 3±0.000 31)丹皮酚中劑量組 7.199 4±0.093 92) 0.135 7±0.001 62)丹皮酚大劑量組 6.440 3±0.127 12) 0.142 5±0.001 22)Ba LPS誘導組組別 TLR4值( ×10－4)Iκ

2.3 丹皮酚對細胞 IκBa mRNA表達的影響 見表 1。HUEVC-C用LPS誘導1 h后，IκBa基因表達明顯低于健康組(P＜0.001)，而丹皮酚對LPS引起的IκBa降解有明顯的抑制作用，從而抑制了NF-κB的活化，且呈劑量依賴性，說明丹皮酚可作為NF-κB活化抑制劑，調控細胞內NF-κB的表達。

2.4 丹皮酚對細胞TLR4蛋白表達的影響 見圖1。HUEVCC用LPS誘導24 h后，TLR4蛋白表達明顯高于健康組，而丹皮酚對LPS引起的TLR4高表達有明顯的抑制作用，說明丹皮酚可作為TLR4活化抑制劑，調控了細胞內TLR4的表達，呈劑量依賴性降低TLR4蛋白的高表達。

2.5 丹皮酚對細胞IκBa蛋白表達的影響 見圖2。HUEVCC用LPS誘導1 h后，IκBa基因表達明顯低于健康組，而丹皮酚呈劑量依賴性抑制IκBa蛋白的降解。說明丹皮酚可作為IκBa降解的抑制劑，從而抑制了 NF-κB的活化，調控細胞內NF-κB 的表達。

圖1 TLR4及β-actin Western印跡結果

圖2 IκBa及β-actin Western印跡結果

3 討論

EH的病因及發病機制至今不明，近年，內皮細胞損傷、炎癥、免疫在EH中的作用日漸受到重視，大量研究表明，EH與血管內皮細胞損傷、炎癥標志物、免疫功能障礙改變有關〔2～8〕，表明內皮細胞損傷、炎癥反應和免疫紊亂在EH的發生發展中扮演著重要角色，為研究EH的發病機制和治療提供了新的思路。可被LPS誘導的TLR-NF-κB信號途徑，最突出的生物學功能就是促進細胞因子合成與釋放，參與炎癥反應和免疫反應，在內皮細胞參與的炎癥免疫反應中表達并發揮作用，因此加深TLR信號系統在EH中作用的理解，可能幫助我們了解EH的發病機制。EH與內皮細胞損傷、炎癥、免疫以及TLR-NF-κB信號途徑之間存在共同的交叉點，我們的前期研究也證明EH患者血清可致內皮細胞損傷〔9〕，而系列藥物都可以降低與炎癥免疫密切相關的黏附分子表達〔10～12〕，有內皮細胞保護作用。因為NF-κB的激活可導致內皮細胞黏附分子的表達，所以我們認為這類藥物可能作用于TLR-NF-κB信號途徑而引起黏附分子表達下降。本結果說明EH患者組較健康組存在著嚴重的炎癥反應和免疫紊亂。

1 華 琦，李 梅，劉力松，等.高血壓病患者脈壓與內皮功能損害的相關性〔J〕. 中華內科雜志，2003;42(8)：574-5.

2 Vaziri ND，Rodriguez-Iturbe B.Mechanisms of disease：oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of hypertension〔J〕.Nat Clin Pract Nephro，2006;2(10)：582-93.

3 崔琪瓊，張 薇，鄭兆通，等.原發性高血壓并發陣發性房顫心房結構和功能的研究〔J〕.中國分子心臟病學雜志，2005;5(4)：585-7.

4 宋衛華，黨愛民，劉國仗.原發性高血壓相關基因研究進展〔J〕.中國分子心臟病學雜志，2005;5(2)：500-2.

5 廖玉華，周子華，魏宇淼，等.高血壓中免疫介導血管重塑發病機制及其標志物研究〔J〕.醫學研究雜志，2007;36(3)：5-6.

6 Das UN.Hypertension as a low-grade systemic inflammatory condition that has its origins in the perinatal period〔J〕.J Assoc Physicians India，2006;5(4)：133-42.

7 成 威，舒春明，周勝華.冠心病和高血壓病的免疫機制進展〔J〕.現代生物醫學進展，2009;9(2)：362-4.

8 宋衛華，黨愛民，劉國仗.原發性高血壓相關基因研究進展〔J〕.中國分子心臟病學雜志，2005;5(2)：500-2.

9 賈會欣，陳利國，彭志允，等.高血壓病患者血清對血管內皮細胞DNA損傷的實驗研究〔J〕.山東大學學報，2009;47(7)：54-6.

10 胡小勤，陳利國，屈 援.生化湯對血瘀證大鼠血管內皮細胞黏附分子表達的影響〔J〕. 中成藥，2006;28(9)：1330-3.

11 陳利國，屈 援，葛紅穎，等.補陽還五湯對血瘀證大鼠血管內皮細胞黏附分子表達的影響〔J〕.中草藥，2005;36(5)：706-9.

12 陳利國，屈 援，胡小勤，等.穎犀角地黃湯對腎上腺素與低溫處理大鼠血管內皮細胞黏附分子表達的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2006;22(3)：547-50.