成年和老年大鼠腦出血后海馬齒狀回神經干細胞增殖分化的比較

文玉軍 王登科 孫 征 劉海洋 張蓮香 王效軍 秦 毅

(寧夏醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，寧夏 銀川 750004)

腦出血后(TCH)，出血灶內神經元壞死，出血灶周圍神經細胞大量凋亡，患者出現明顯的神經功能障礙。減少出血灶周圍神經元的凋亡，促進腦內神經干細胞(NSCs)增殖并向神經元分化對腦出血后患者的神經功能恢復有重要意義。腦出血多發于老年人，而目前大部分的研究是以成年動物為模型進行的〔1〕，因此，本研究比較成年和老年大鼠腦出血后海馬齒狀回NSCs的增殖、分化，探討腦出血后NSCs的變化規律。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 選用健康成年(3月齡，250～300 g)和老年(18～24月齡，400～550 g)SD大鼠，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號 SCXK(寧)20050001，分組如下：(1)檢測細胞增殖的分組：實驗組選用制備成功的成年和老年腦出血模型大鼠各30只，每組隨機分為3、7、14、21、28 d五個亞組，每亞組 6 只;正常組成年和老年大鼠各6只;假手術組成年和老年大鼠各6只，術后7 d取材。全部按脈沖法標記。(2)檢測細胞分化的分組：正常組和實驗組成年和老年大鼠各6只，按累計法標記，術后28 d取材。(3)大鼠腦出血模型的制備：參照Rosenberg等〔2〕的方法加以改良，即選用0.5 U/μlⅦ型膠原酶和 6.25 U/μl肝素的混合液0.22 μl立體定位注射到大鼠尾狀核建立腦出血模型。假手術組注入等量生理鹽水，正常組大鼠不作任何手術處理。(4)大鼠行為學評分：參照Bederson評分標準〔3〕對造模后大鼠進行評分，選取1～4分大鼠用于后續實驗。

1.2 BrdU標記增殖細胞 (1)脈沖標記：大鼠處死前24 h腹腔注射5 mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50 mg/kg，間隔4 h注射1次，連續注射3次，最后一次注射后24 h處死動物。此法用于標記NSCs的增殖變化。(2)累積標記：大鼠腹腔注射5 mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50 mg/kg，每天1次，連續注射3、28 d后處死大鼠。此法能標記較多的BrdU陽性細胞，用于檢測增殖細胞的分化情況。

1.3 細胞增殖和分化的檢測

1.3.1 BrdU免疫組化染色 經脈沖標記的各組大鼠按時間點常規心內灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續冠狀切片，片厚7 μm，進行免疫組化(SP法)檢測。切片60℃烘烤過夜，常規脫蠟至水正常山羊血清封閉(20 min，不沖洗)，加入小鼠抗大鼠BrdU抗體(1∶100，4℃過夜)，生物素標記的二抗工作液(37℃，30 min)，HRP標記的鏈霉卵白素工作液(37℃，30 min)，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。小鼠抗大鼠BrdU抗體購自北京中杉公司，選擇推薦的乳腺癌標本作陽性對照、PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.2 BrdU/神經元核抗原(NeuN)和BrdU/膠質纖維酸蛋白(GFAP)雙標染色 經累計標記的各組大鼠按時間點常規灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續冠狀切片，片厚7 μm，進行免疫組化雙標(SAP/SP法)檢測。BrdU染色除不滴加3%H2O2外，余步驟同前，用堿性磷酸酶復合物代替HRP復合物，滴加NBT/BCIP顯色30 min(深藍色)。然后分別行NeuN和GFAP染色DAB顯色。小鼠抗大鼠NeuN抗體和兔抗大鼠GFAP抗體均購自北京中杉公司，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果觀察及數據處理 每只大鼠選3～5張切片，在400鏡下，每張切片取血腫周圍海馬齒狀回5個不重復視野區，計數BrdU陽性細胞數和BrdU/NeuN或BrdU/GFAP雙標細胞數，利用SPSS12.0統計軟件進行數據統計，實驗數據用s表示，進行方差齊性檢驗，方差齊采用多組間兩兩比較的方差分析q檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 大鼠行為學變化和腦出血灶病理學改變 模型組大鼠在術畢清醒后即可觀察到神經功能缺損癥狀，出現腦出血灶對側偏癱癥狀，表現為肢體活動遲緩，進食減少，多數大鼠易倒不能臥立，有拖步行走或旋轉爬行等神經功能缺損表現。術后6～24 h神經功能障礙最為明顯，行為學評分值多為4分。腦組織HE染色顯示患側尾狀核部位神經元大量壞死，形成出血壞死灶，周圍腦組織疏松，細胞腫脹，有炎性細胞浸潤，毛細血管管壁腫脹、破裂。

2.2 成年和老年大鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數的變化及相互比較 正常組、假手術組和各出血組成年和老年大鼠的雙側海馬齒狀回均可見BrdU陽性細胞，主要分布在顆粒下區(SGZ)，細胞形態圓而規則，著色均勻。正常組、假手術組大鼠BrdU陽性細胞較少，散在分布，胞核呈圓形淡染，兩組陽性細胞數量無顯著性差異(P＞0.05)，但成年大鼠兩組BrdU陽性細胞明顯多于老年大鼠(P＜0.01)。見圖1。

成年和老年各出血組BrdU陽性細胞明顯增加，與正常組、假手術組相比有顯著性差異(P＜0.01)。出血側SGZ區的BrdU陽性細胞數在術后3 d明顯增多，7 d達到峰值，14 d后BrdU陽性細胞逐漸減少，28 d時仍高于正常組和假手術組，且成年大鼠各時間點BrdU陽性細胞均高于老年大鼠(P＜0.01)。出血對側SGZ區也可見BrdU陽性細胞增多，7 d時達到峰值，之后逐漸下降，與正常組、假手術組相比，各時段均有顯著性差異(P＜0.01)，且成年大鼠陽性細胞數均高于老年大鼠，差異有統計學意義(P＜0.01)。出血對側BrdU陽性細胞增加的幅度均較相應出血側低，兩側比較有顯著性差異(P＜0.01)。見圖2，圖 3，見表 1。

表1 成年和老年大鼠腦出血后雙側SGZ區BrdU陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6，s)

表1 成年和老年大鼠腦出血后雙側SGZ區BrdU陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6，s)

與老年大鼠比較：1)P＜0.01;與正常組比較：2)P＜0.01;與假手術組比較：3)P＜0.01;與出血對側比較：4)P＜0.01

組別 成年大鼠腦出血側43.97±4.29 44.57±3.20假手術組 54.17±3.481) 52.47±4.67 45.60±3.38 45.10±3.52腦出血后3 d 102.53±2.981)2)3) 61.27±3.991)2)3)4) 80.07±5.271)2) 54.70±4.051)2)3)腦出血后7 d 171.20±5.011)2)3) 104.63±5.281)2)3)4) 129.20±7.941)2) 97.77±5.211)2)3)腦出血后14 d 119.33±5.701)2)3) 75.13±3.381)2)3)4) 110.63±5.561)2) 92.00±6.111)2)3)腦出血后21 d 99.00±4.611)2)3) 64.77±2.741)2)3)4) 68.03±6.251)2) 55.60±4.871)2)3)腦出血后28 d 65.17±3.241)2)3) 59.83±3.241)2)3)4) 55.13±3.811)2) 47.87±4.381)2)4)出血對側正常組 52.30±3.491) 53.17±4.541)出血對側成年大鼠腦出血側

2.3 免疫組化雙標結果 表2可見，和脈沖標記相比，累積標記的成年和老年大鼠腦內BrdU陽性細胞明顯增多，在SGZ區、紋狀體、胼胝體均可見大量的BrdU陽性細胞，而且成年大鼠多于老年大鼠。免疫組化雙標結果顯示，雙標細胞主要見于SGZ周圍，正常大鼠腦內可見少量散在雙標細胞，腦出血后雙標細胞數明顯增加(P＜0.01)。BrdU/NeuN雙標細胞核大深染呈圓形，中央呈深藍色BrdU陽性，周邊呈棕色NeuN陽性(圖4)，BrdU/GFAP雙標細胞核藍色淺染呈橢圓形，突起呈棕色長短不一(圖5)。其中老年大鼠BrdU/GFAP雙標細胞陽性率明顯高于成年大鼠，而BrdU/NeuN雙標細胞陽性率則明顯低于成年大鼠，兩組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。

表2 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區雙標陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6，s)

表2 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區雙標陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6，s)

與正常組比較：1)P＜0.01;與成年大鼠比較：2)P＜0.01

8.63±1.52 20.20±3.08 5.77±1.10 13.37±1.33 28 d組 24.60±3.341) 23.90±2.991)15.77±2.051)2)26.27±3.421)2)BrdU/NeuN BrdU/GFAP正常組組別 成年大鼠BrdU/NeuN BrdU/GFAP 老年大鼠

圖1 正常成年和老年大鼠海馬齒狀回SGZ區BrdU陽性細胞(SP法，×400)

圖2 成年大鼠腦出血后出血側SGZ區BrdU陽性細胞(SP法，×400)

圖3 老年大鼠腦出血后出血側SGZ區BrdU陽性細胞(SP法，×400)

3 討論

在成體中樞神經系統，NSCs主要存在于腦室的室管膜下層(SVZ)和海馬齒狀回SGZ〔4〕，NSCs具有星形膠質細胞的特性，從神經管至腦發育晚期一直存在，后形成放射狀膠質，是新形成神經元的父本并指導新神經元的遷移〔5〕。NSCs在自然增殖過程中不斷增殖分化，并遷移到特定區域，以取代老化的神經元，從而保護腦結構和功能的完整性〔6〕。生理狀態下，成體腦內SVZ和SGZ的NSCs大部分處于靜止期，在運動、學習、環境改變或腦缺血、缺血再灌注、腦梗死等病理性因素刺激下，其增殖分化可明顯增強〔7〕。腦損傷能不同程度地激活腦內NSCs，促進其增殖、分化并遷移至受損部位，參與損傷后神經結構重建和功能恢復〔8〕。

圖4 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區BrdU/NeuN雙標細胞(SAP/SP法，×400)

圖5 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區BrdU/GFAP雙標細胞(SAP/SP法，×400)

本研究結果顯示，隨著出血時間的推移，出血灶不斷機化、縮小，病理刺激減輕等因素有關。出血對側BrdU陽性細胞數較出血側少，但兩側細胞增殖的變化規律是一致的，提示雖然出血對側受到的傷害性刺激相對較弱，但腦出血后機體處于應激狀態，腦微環境的變化可能對雙側腦區NSCs的數量及其增殖活性均有很大影響，另外也可能與機體神經體液調節等作用有關〔9〕。Veizovic等〔10〕將標記的 NSCs植入成年大鼠缺血對側的腦組織，經免疫組化染色發現缺血側腦組織有移植的NSCs出現，結合本研究，提示成年后腦內可能還保留有早期的細胞遷移機制，并可在腦出血等腦損傷后得以活化、啟動。

研究表明海馬與學習、記憶密切相關，在SGZ每天可產生大量的新生神經元〔11〕，但隨著年齡的增長SGZ的NSCs增殖能力會不斷下降〔12〕。本研究結果提示腦老化后微環境的變化可能對相關腦區NSCs的數量或其增殖活性有影響。通過連續3 d給大鼠腹腔注射BrdU觀察成年和老年大鼠腦出血后SGZ增殖細胞的分化情況，免疫組化結果顯示，BrdU/NeuN和 BrdU/GFAP雙標細胞主要見于SGZ周圍腦區，腦出血后雙標細胞數明顯增加。在腦缺血、腦出血等腦損傷后，腦內會釋放各種刺激因子，如SDF-1因子、凝血酶、促紅細胞生成素等，同時與神經生長有關的生長因子、營養因子和細胞因子等也相繼釋放〔13〕，這些因素可促進SGZ干細胞的增殖與分化，除了分化產生新生神經元以補充神經元的丟失外，還產生大量的膠質細胞參與病灶的瘢痕修復。與成年相比，老年后腦內微環境的變化使某些營養因子缺乏，有害物質積聚，使得NSCs的增殖分化受到抑制，另外，老年后腦內毛細血管明顯減少，其超微結構及血管形狀發生明顯變化，腦血流量也顯著下降，這些變化不僅可導致原有神經元的退行性變，還直接影響新生神經元的增殖和存活〔14〕。

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