鈣蛋白酶與谷氨酸的興奮性毒性

王 蕊 金 英 劉婉珠 隋海娟 (遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧 錦州 2000)

谷氨酸是中樞神經系統的興奮性神經遞質，但其濃度過高將引起神經毒性。中風、顱腦損傷、癲癇〔1～3〕等急性腦病引起谷氨酸大量釋放，導致神經毒性。此外，退行性神經疾病如阿爾茨海默病(AD)的發病機制也牽涉到興奮性毒性〔4〕。高濃度谷氨酸引起NMDA受體過度激活，使Ca2+大量進入神經元，并進一步激活其下游鈣蛋白酶。鈣蛋白酶是半胱氨酸蛋白水解酶，有兩種異構體，鈣蛋白酶Ⅰ(μ-calpain)和鈣蛋白酶Ⅱ(mcalpain)。兩種鈣蛋白酶激活所需的鈣離子濃度不同，鈣蛋白酶Ⅰ的激活需要微摩爾級的鈣濃度，鈣蛋白酶Ⅱ的激活需要毫摩爾級的鈣濃度〔5〕。兩種鈣蛋白酶的作用底物相似，它們的過度激活與細胞損傷有著密切的關系〔6〕。本研究采用乳鼠大腦皮質神經元進行體外培養，觀察鈣蛋白酶Ⅰ在谷氨酸作用后的表達、細胞內定位及鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170對神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 谷氨酸，二甲基亞砜(DMSO)，DMEM，F12培養基，Hoechst 33258，胰蛋白酶(trypsin，1∶250)，L-多聚賴氨酸(poly-L-lysine)均購自Sigma公司。MTT試劑購于碧云天生物技術研究所。胎牛血清、HEPES、馬血清購于北京華美轉導科技有限公司。鈣蛋白酶Ⅰ大亞單位多克隆抗體購于Cell Signal公司(Beverly，MA，USA)。MDL-28170，兔抗神經元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體，鼠抗神經絲蛋白(NF200)單克隆抗體，山羊抗兔、山羊抗鼠二抗均購自Santa Cruz公司。β-肌動蛋白抗體和NBT/BCIP顯色液購于Beyotime試劑公司。

1.2 細胞培養 取出生24 h以內的SD大鼠乳鼠(遼寧醫學院實驗動物中心提供)。75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出大腦皮層，置于培養基中，剔除血管和軟腦膜，剪成1 mm3左右的小塊。加入0.125%胰蛋白酶，37℃消化10 min。待細胞分散后，加入含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養基，終止消化。200目篩網過濾，離心10 min，用含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養基制成細胞懸液，調整細胞密度為(1～10)×108/L，接種在鋪有L-多聚賴氨酸24孔或6孔培養板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。培養48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg/L)的培養基，抑制非神經細胞增殖。以后每3天換液1次，培養7 d后用于實驗。應用抗NSE多克隆抗體和抗NF200抗體免疫熒光染色進行神經元純度鑒定，結果表明神經元純度在90%以上。

1.3 實驗分組 細胞分為對照組;谷氨酸組：加入谷氨酸(100 μmol/L)作用 24 h;谷氨酸 +MDL-28170組：先加入MDL-28170(10 μmol/L)作 用 30 min，然 后 加 入 谷 氨 酸(100 μmol/L)作用 24 h;MDL-28170 組：加入 MDL-28170(10 μmol/L)作用24 h，MDL-28170 濃度根據文獻報道〔7〕和預實驗確定。

1.4 MTT法測定細胞活力 將接種在96孔培養板的神經元按以上分組處理后，加入MTT(終濃度0.5 g/L)培養4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，待顆粒溶解后，在570 nm的吸光值下檢測各孔的吸光度值(A)，并根據公式計算細胞生存率。細胞生存率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A正常對照組-A空白組)×100%。

1.5 Hoechst33258核染色檢測細胞凋亡情況 依據Jin等〔8〕的方法，按以上分組加入藥物處理后，移去培養基，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，4%的多聚甲醛固定20 min，棄固定液，雙蒸水沖洗2次，Hoechst33258 5 mg/L避光染色10 min，用雙蒸水沖洗2次，室溫晾干后于熒光顯微鏡(Olympus)下觀察拍照。每組取4張蓋玻片，每張片隨機選取4個高倍視野，計算凋亡細胞占每個視野總細胞數的百分比，求出16個視野平均百分比，作為該樣本的凋亡百分比。

1.6 免疫熒光染色檢測鈣蛋白酶Ⅰ表達 培養7 d的皮層神經元，經各因素處理后，移去培養基，用冷PBS洗2次，然后用4%的多聚甲醛固定30 min，棄固定液，PBS洗3次，每次10 min，然后用 TritonX-100 0.3%作用30 min，PBS洗3次，每次10 min，3%BSA封閉30 min，然后加入鈣蛋白酶Ⅰ大亞基的多克隆抗體(1∶100)4℃過夜后，PBS洗3次，再加入羅丹明標記的二抗，37℃孵育2 h，PBS洗3次，Hoechst33258核復染10 min，PBS洗3次，每次10 min，最后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 Western蛋白印跡檢測鈣蛋白酶Ⅰ蛋白水平 原代培養的神經細胞，經各種因素處理后，用冷PBS沖洗，立即放入預冷的裂解緩沖液中4℃ 超聲粉碎后，離心30 min，取上清，用Lowry等法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準品，將各組蛋白濃度調成一致。用10% ～12%(SDS-PAGE分離蛋白質，每個泳道蛋白上樣量為20 μg。為了準確判斷目的蛋白帶的位置，一個泳道加SeeBlue Plus 2預染蛋白標記物，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用TBS，洗膜3次，每次10 min。將膜放入一抗中(抗體1∶500稀釋)，4℃過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min，置硝基四氮唑藍/5溴-4氮-3吲哚磷酸鹽(NBT/BCIP)顯色液中顯色，直至出現，終止反應。每個抗體測定時都將與β-actin相應的膜用TBS洗3次后，將膜放入βactin抗體中，4℃過夜，進行雜交，TTBS沖洗后，將膜放入二抗中，室溫孵育1 h。再用TTBS洗膜3次后，放入NBT/BC IP顯色液中避光顯色，直至顯色，終止反應，以保證蛋白上樣量的一致性。將蛋白印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動分析成像軟件Chem Image 5500對蛋白帶進行積分吸光度值(IA)分析。

2 結果

2.1 MDL-28170抑制谷氨酸引起的神經元細胞活力降低 谷氨酸組神經元細胞活力較對照組明顯降低〔(71.5±6.1)%vs(100.0±5.4)%，P＜0.01〕，谷氨酸+MDL-28170組較谷氨酸組明顯升高〔(89.0±2.6)%，P＜0.01〕。MDL-28170單獨使用對神經元細胞活力沒有影響〔(97.5±1.9)%，P＞0.05〕。

2.2 MDL-28170抑制谷氨酸引起的神經元凋亡 圖1可見，對照組神經元凋亡百分比為(8.7±1.3)%(n=16)，谷氨酸組為(35.4±6.9)%(n=16，與對照組比較 P＜0.01)，谷氨酸+MDL-28170組為(13.4±1.6)%(n=16，與谷氨酸組比較P＜0.01)，MDL-28170單獨應用對細胞凋亡百分比沒有影響(10.7±1.1)%。凋亡神經元的特征是胞核縮小，染色質濃縮，或核碎裂(圖1，箭頭)。

2.3 谷氨酸引起皮質神經元鈣蛋白酶Ⅰ表達增加 鈣蛋白酶Ⅰ免疫熒光染色結果顯示，谷氨酸作用24 h后，鈣蛋白酶Ⅰ表達較對照組明顯增多，而且鈣蛋白酶Ⅰ主要表達在凋亡的細胞核內(箭頭所示)。Western蛋白印跡結果顯示，與對照組相比谷氨酸組80 kD和76 kD鈣蛋白酶Ⅰ蛋白水平明顯增加。見圖2、圖 3。

圖1 MDL-28170抑制谷氨酸引起的皮質神經元凋亡(×400)

圖2 谷氨酸對皮質神經元鈣蛋白酶Ⅰ蛋白水平的影響

圖3 谷氨酸對鈣蛋白酶Ⅰ(μ-calpain)表達的影響(×400)

3 討論

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體是鈣通道耦聯受體。細胞外異常增多的谷氨酸過度激動NMDA受體使鈣離子大量進入細胞內并激活鈣蛋白酶。鈣蛋白酶由大亞基(80 kD)和小亞基(30 kD)構成，激活時首先大小亞基分離，然后大亞基自溶產生76 kD活性產物〔9〕。本研究發現谷氨酸作用24 h后，鈣蛋白酶80 kD大亞基與76 kD活性產物明顯增多，而鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170明顯抑制了谷氨酸引起的神經元損傷。鈣蛋白酶被激活后通過水解細胞骨架蛋白，可引起細胞形態的改變;此外鈣蛋白酶還可劈切抗凋亡蛋白Bcl-2，導致細胞色素c的釋放而激活線粒體途徑的凋亡通路〔10〕。本研究發現谷氨酸作用24 h后，鈣蛋白酶在凋亡的細胞核中大量表達，而在胞漿和存活的細胞核中表達較少，可能是鈣蛋白酶在細胞凋亡的過程中發生了核移位。本研究證明鈣蛋白酶在谷氨酸作用后被大量激活，并在細胞凋亡過程中移位至細胞核，鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170對谷氨酸引起的皮質神經元損傷具有保護作用。

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7 James R，Brorson MD，Charles J，et al.Delayed Antagonism of Calpain reduces excitotoxicity in cultured neurons〔J〕.Stroke，1995;26：1259-67.

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