抑制COX-2/PGE2通路對膠質瘤細胞免疫抑制因子表達的影響

張向萍 張洪濤 修春明 遲 楠 崔廣強 王云波 湯國太

(青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院藥劑科，山東 煙臺 264000)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤預后差，復發率高。環氧化酶-2(COX-2)在包括膠質瘤在內的多種人體腫瘤中均有較高水平的表達，而且與腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、轉移及免疫缺陷等有密切的關系;前列環素E2(PGE2)是COX-2的主要代謝產物〔1〕，因此COX-2/PGE2通路是腫瘤生物治療的一個重要靶點。免疫逃逸是膠質瘤發生發展的一個重要因素，腫瘤微環境中分泌的免疫抑制因子是導致腫瘤免疫逃逸的主要原因。主要的免疫抑制因子包括轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)以及PGE2等〔2〕。本課題組前期研究發現膠質瘤COX-2表達上調，與腫瘤病理級別及增殖呈正相關〔3〕。本文觀察選擇性COX-2抑制劑celecoxib阻斷COX-2/PGE2通路后對膠質瘤細胞主要免疫抑制因子表達的影響，探索COX-2抑制劑在膠質瘤免疫治療中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 膠質瘤C6細胞株購自上海中國科學院生命科學研究所。RPMI1640粉劑為Gibco公司產品，RT-PCR試劑盒購自Takara公司，ELISA試劑盒購自晶美公司，COX-2單克隆抗體購自Santa Cruz公司，Western印跡試劑盒購于武漢博士德生物制品公司，celecoxib購自西爾公司(美國);10%小牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡檢測 celecoxib作用后C6細胞COX-2表達 取對數生長期的C6細胞，制備單細胞懸液(2×105個細胞/ml)，按3 ml/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，分別更換含不同濃度(0，10，25，50，100 μmol/L)celecoxib 的培養基，繼續培養24 h，胰酶消化收獲各濃度藥物作用的細胞，加入200 μl用冰預冷的細胞裂解液制備細胞總蛋白，Bradford方法測定蛋白質濃度。取蛋白溶液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，將凝膠中的蛋白電轉移到硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，隨后加入抗COX-2抗體、抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體，4℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，二氨基聯苯胺(DAB，0.05%)-H2O2(0.01%)顯色，對染色的蛋白質譜帶進行掃描分析讀取吸光度(A)，計算其與β-actin的比值。

1.2.2 RT-PCR檢測VEGF、TGF-β mRNA表達 取對數生長期的C6細胞，制備單細胞懸液(2×105個細胞/ml)，按3 ml/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，更換含50 μmol/L celecoxib的培養基，繼續培養48 h，對照組僅更換培養基。按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，測其濃度，取總RNA 4 μg進行逆轉錄。PCR 反應體系為 50 μl，擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min×32個循環，72℃ 10 min(引物設計見表1)。取5 μl反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察照相，凝膠成像系統分析灰度值，結果取目的基因條帶與βactin條帶灰度值的比值。

1.2.3 ELISA法檢測celecoxib作用C6細胞后PGE2、VEGF、TGF-β分泌水平 C6細胞的制備同 RT-PCR實驗，加入50 μmol/L celecoxib后，繼續培養48 h，離心提取C6細胞上清液，根據 ELISA試劑盒說明操作，檢測細胞上清中 PGE2、VEGF、TGF-β水平，每組設3個復孔，結果取3孔均值。

表1 引物設計

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行分析，數據以s表示，多組均數比較采用完全隨機設計資料的方差分析。

2 結果

2.1 celecoxib對C6細胞COX-2蛋白表達的影響 celecoxib作用后可明顯下調 C6細胞 COX-2蛋白表達，10、25、50、100 μmol/L組及對照組 COX-2表達量分別為 0.81±0.03、0.68±0.02、0.32 ±0.02、0.19 ±0.02、0.92 ±0.03;且隨 celecoxib濃度增加其作用更加明顯。見圖1。

圖1 不同濃度celecoxib對C6細胞COX-2表達的影響

2.2 celecoxib對 C6細胞VEGF、TGF-β mRNA表達的影響以50 μmol/L celecoxib 作用于 C6 細胞 48 h 后，VEGF、TGF-β mRNA的表達(0.65±0.67、0.58±0.49)均下調，與對照組(1.06±0.79、0.86±0.65)相比，其灰度比值明顯降低(P＜0.01)。

2.3 celecoxib對 C6細胞上清中 PGE2、VEGF、TGF-β 含量的影響 以50 μmol/L celecoxib作用于C6細胞48 h后，C6細胞上清中 PGE2、VEGF、TGF-β 水平(43.2 ±7.15、72.05 ±7.67、66.51±5.42)與對照組(95.71±14.02、116.0±12.45、104.15±10.67)比較均明顯下降(P＜0.01)。

3 討論

近年來發現，以樹突細胞(DC)為基礎的免疫治療可改善腦膠質瘤患者預后，是對膠質瘤傳統治療的一個重要補充。但由于腫瘤免疫逃逸現象的存在，極大地影響了膠質瘤免疫治療的效果。因此，逆轉膠質瘤免疫逃逸是改善膠質瘤治療效果的有效途徑。膠質瘤產生免疫逃逸現象與多種機制有關，其中一個重要機制是腫瘤微環境中可分泌大量的免疫抑制因子，包括PGE2、VEGF、TGF-β、雙加氧酶(IDO)、白細胞介素-10(IL-10)、一氧化氮合酶2(NOS-2)等，均具有抑制免疫反應的功能，影響免疫細胞對腫瘤的殺傷作用。TGF-β在膠質瘤中具有較高的表達活性，可抑制T細胞、自然殺傷(NK)細胞、B細胞、單核細胞及巨噬細胞等免疫細胞的增殖，并誘導B細胞及T細胞凋亡，還可抑制膠質瘤組織相容性復合物(MHC-Ⅱ類分子)的表達以及抑制抗原提呈細胞活性〔2，4〕。TGF-β的存在可顯著促進IL-10的分泌，IL-10能降低DC的表面分子如 MHC-Ⅱ、CD80及CD86等的表達率，抑制DC的分化成熟，抑制DC的抗原提呈能力，使其無法激活T細胞識別和殺傷腫瘤細胞，從而導致腫瘤細胞的免疫逃逸〔5〕。VEGF是一種34～42 kD的蛋白，可在早期影響DC前體細胞的發育分化，導致DC成熟障礙〔6〕。大量研究證實，COX-2在包括膠質瘤在內的多種惡性腫瘤中均有較高的表達水平，并影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移、血管生成〔1〕;近來還發現COX-2與腫瘤免疫缺陷有密切的關系〔7〕。腫瘤組織高表達的COX-2可通過其催化產物PGE2，導致抗腫瘤免疫系統功能缺陷，使其無法有效識別和殺傷腫瘤細胞〔8〕。PGE2可提高細胞內cAMP水平，抑制巨噬細胞、自然殺傷細胞、T殺傷細胞的活性，抑制干擾素(IFN)-γ、IL-1、IL-2等細胞因子產生，進而抑制機體免疫反應;COX-2/PGE2可以調控TGF-β 及 VEGF 的表達〔9〕。

本課題組在前期研究中，同樣證實了COX-2在高級別膠質瘤組織中具有較高的表達水平，并發現PGE2可改變DC表面分子的表達譜，使其抗原提呈能力減弱，而celecoxib可以部分逆轉這一作用。本文進一步觀察到，celecoxib可抑制膠質瘤細胞COX-2的表達，使其分泌PGE2減少，并可下調 TGF-β及VEGF mRNA的表達，進而減少TGF-β、VEGF分泌。通過這一途徑，可以明顯改善膠質瘤免疫微環境，阻斷其免疫逃逸的發生，并增強其對DC疫苗等免疫治療的效應。進而我們設想，celecoxib聯合DC疫苗可能會具有更好的抗腫瘤效應，或許是提高膠質瘤治療效果的有效途徑。

1 El-Sayed M，Taha MM.Immunohistochemical expression of cycloxygenase-2 in astrocytoma：correlation with angiogenesis，tumor progression and survival〔J〕.Turk Neurosurg，2011;21(1)：27-35.

2 Pellegatta S，Cuppini L，Finocchiaro G.Brain cancer immunoediting：novel examples provided by immunotherapy of malignant gliomas〔J〕.Expert Rev Anticancer Ther，2011;11(11)：1759-74.

3 張洪濤，修春明，田 苗，等.環氧化酶-2和表皮生長因子受體在星形細胞瘤中表達的意義〔J〕.中國醫師雜志，2010;12(2)：185-7.

4 Zagzag D，Salnikow K，Chiriboga L，et al.Downregulation of major histocompatibility complex antigens in invading glioma cells：stealth invasion of the brain〔J〕.Lab Invest，2005;85(3)：328-41.

5 Teicher BA.Transforming growth factor-beta and the immune response to malignant disease〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(21)：6247-51.

6 Johnson BF，Clay TM，Hobeika AC，et al.Vascular endothelial growth factor and immunosuppression in cancer：current knowledge and potential for new therapy〔J〕.Expert Opin Biol Ther，2007;7(4)：449-60.

7 Kalinski P.Regulation of immune responses by prostaglandin E2〔J〕.J Immunol，2012;188(1)：21-8.

8 El-Sayed M，Taha MM.Immunohistochemical expression of cycloxygenase-2 in astrocytoma：correlation with angiogenesis，tumor progression and survival〔J〕.Turk Neurosurg，2011;21(1)：27-35.

9 Tian M，Schiemann WP.PGE2 receptor EP2 mediates the antagonistic effect of COX-2 on TGF-beta signaling during mammary tumorigenesis〔J〕.FASEB J，2010;24(4)：1105-16.