氧化高密度脂蛋白及其亞型對人臍靜脈內皮細胞組織因子途徑抑制物-1表達的影響

彭湘萍 苑 聰 姜志勝 任 重 趙戰芝 卜梓斌 唐志晗 劉錄山 黃宜娥 聶德波

肖文虎1，2 劉艷文1，2 (吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000)

組織因子途徑抑制物(TFPI)是近年發現的最強的生理性抗凝物質，有兩種異構體：TFPI-1和TFPI-2，前者主要由血管內皮細胞合成，在抑制血栓形成和血管重塑等方面發揮重要作用〔1〕。血漿中的天然高密度脂蛋白(HDL)具有直接的抗動脈粥樣硬化(AS)和血管保護作用〔2〕。利用密度梯度超速離心可將 HDL 分為 HDL1、HDL2、HDL3三類〔3〕。Asztalos 等〔4〕報道HDL對心血管的保護作用與HDL亞型在血中的相對含量、顆粒大小有關，而HDL亞型分布異?？赡苁怯绊慉S發生的重要原因。已有學者提出血清HDL亞型組成及含量變化可作為評價AS危險性及其嚴重程度的一個指標〔5〕。本研究旨在探索oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對內皮細胞TFPI-1 mRNA和蛋白表達的影響，為闡明oxHDL及其亞型在AS血栓形成中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人臍靜脈內皮細胞HUVEC-12細胞株來源于中南大學湘雅醫學院細胞中心;RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物公司);兔抗人TFPI-1多克隆抗體，羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗(Santa cruz);β-actin鼠抗人一抗，兔抗鼠辣根過氧化物酶標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司);BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);引物均由上海生工生物工程服務有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.2 HDL及其亞型的制備、氧化與鑒定 健康人血漿購自衡陽市血站。采用本實驗室常規方法〔6〕密度梯度超速離心分離HDL(1.063 ～1.21 g/ml)、HDL2(1.063 ～1.125 g/ml)、HDL3(1.125～1.21 g/ml)，固體KBr調密度。將分離的HDL、HDL2、HDL3均分成兩部分，一部分用含0.1%EDTA的PBS溶液透析48 h;另一部分同樣方法進行透析后，1 mg/ml HDL、HDL2和HDL3分別在37℃與含20 μmol/L CuSO4的PBS溶液孵育24 h進行氧化修飾。BCA法蛋白定量，過濾除菌，4℃保存備用。瓊脂糖凝膠電泳法及硫代巴比妥法鑒定oxHDL及其亞型修飾情況。取氧化前后的 HDL、HDL2、HDL3經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，2.5%考馬斯亮藍常規染色，脫色后可見清晰的脂蛋白和氧化修飾脂蛋白條帶，凝膠成像系統掃描收集圖像。按MDA試劑盒操作方法，532 nm處可見光分光光度計測各管吸光度值，計算MDA含量。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應 收集細胞，總RNA提取試劑提取總RNA，各標本取0.2 g總RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄。TFPI-1引物序列上游：5'-CAACTCTGATACAAACGTGTTGA-3'，下游 5'-CTACTACAATTCAGTCATTGGGA-3'，PCR擴增產物長度374 bp;內參照采用GAPGH，引物序列上游 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3'，下游 5'-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'，PCR擴增長度為697 bp。PCR反應條件為：94℃預變性 3 min，94℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃ 10 min繼續延伸。反應結束后，取RT-PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統對電泳條帶拍照以及分析，以各組目的基因與內參基因的吸光度值的比值比較目的基因mRNA表達差異。每組實驗重復3次。

1.4 Western印跡 將變性過的蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%，電泳后半干轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉4℃過夜，一抗以最佳濃度稀釋后常溫2 h或4℃孵育12 h，TBST洗膜3×15 min，洗膜后用相應辣根過氧化物酶二抗常溫孵育2 h，TBST洗膜3×15 min，暗室顯影。

2 結果

2.1 HDL氧化修飾鑒定 HDL及其亞型經CuSO4孵育后，HDL、HDL2、HDL3中 MAD 含 量 分 別 由 2.82、2.95、3.46 nmol/ml升至 29.23、30.64、37.18 nmol/ml，具有顯著性差異(P＜0.01)。說明氧化后MDA含量增高，HDL及其亞型發生了氧化修飾。同時，由于陰離子含量增多，氧化修飾后電泳遷移率明顯加快，表明已被氧化修飾。見圖1。

2.2 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對 HUVECs細胞TFPI-1mRNA表達的影響 不同濃度的HDL、HDL2、HDL3孵育HUVECs細胞24 h后，各濃度組TFPI-1 mRNA表達變化不明顯。用不同濃度的 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3(10、20、40、80 mg/L)孵育HUVECs細胞24 h后，各濃度組TFPI-1 mRNA的表達均有所減少，其中在oxHDL和oxHDL3各系列濃度中以40 mg/L時作用最明顯，TFPI-1 mRNA表達分別為0 mg/L組的72%、51%，下降了28%、49%;在 oxHDL2各系列濃度中以80 mg/L作用最明顯，TFPI-1 mRNA表達為0 mg/L組的73%，下降了27%，差異均具有(P＜0.05)。見圖2。

2.3 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對 HUVECs細胞TFPI-1蛋白表達的影響 與0 mg/L組比較，不同濃度的ox-HDL、oxHDL2、oxHDL3(10、20、40、80 mg/L)組 TFPI-1 蛋白表達減少，其中在oxHDL和oxHDL3各系列濃度中以40 mg/L作用最明顯，TFPI-1蛋白表達分別為0 mg/L組的65%、53%，下降了35%、47%;在oxHDL2各系列濃度中以80 mg/L時作用最明顯，TFPI-1蛋白表達是0 mg/L組的73%，下降了27%，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖3，表1。

圖1 oxHDL、HDL及其亞型瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1蛋白表達的影響(s)

表1 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1蛋白表達的影響(s)

濃度(mg/L)oxHDL oxHDL2 oxHDL3 0 0.823±0.022 0.945±0.053 0.555±0.051 10 0.820±0.047 0.914±0.064 0.547±0.042 20 0.677±0.035 0.790±0.032? 0.456±0.033 40 0.532±0.030 0.732±0.025 0.292±0.024 80 0.547±0.012 0.691±0.055 0.312±0.034

圖2 不同濃度oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1 mRNA表達的影響

圖3 不同濃度oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1蛋白表達的影響

3 討論

oxHDL是導致AS的一個危險因素。HDL發生氧化修飾以后，其化學組成成分、化學性質以及生物學功能均發生變化，轉運膽固醇的能力下降，喪失了抑制LDL氧化修飾的能力，破壞凝血和纖溶平衡，引起血小板聚集。促進AS發生。文獻報道〔7〕，oxHDL能抑制內皮細胞一氧化氮合酶(NOS)的合成和一氧化氮(NO)的產生，促進內皮細胞釋放內皮素-1(ET-1)，影響血管正常的舒張和收縮功能。oxHDL可上調血管緊張素轉化酶(ACE)表達，使血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成增多，造成內皮功能不良。體外研究發現，oxHDL引起的凝血酶原時間(PT)及活化部分凝血活酶時間(APTT)明顯短于 HDL〔8〕。Giuseppe等〔9〕報道，oxHDL3通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，促進內皮細胞纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)mRNA表達和相應的抗原生成，加速血栓形成。

本研究發現oxHDL及其亞型能抑制HUVECs TFPI-1 mRNA和蛋白表達，其中oxHDL3的作用最強。TFPI是外源性凝血途徑起始步驟的生理性抑制物，是目前唯一能抑制組織因子(TF)活性的生理活性物質，TFPI-1對AS及其并發癥有拮抗作用。文獻報道，在AS斑塊破裂之前，TFPI和TF同時出現在壞死區周圍的巨噬細胞以及纖維帽的血管內皮細胞、平滑肌細胞中，但在脂質豐富區卻只有TF而沒有TFPI，提示如果缺乏TFPI對TF的抑制作用，易引起 AS并發癥〔10〕。Westrick 等〔11〕通過對小鼠的研究發現TFPI能有效地防止AS的發生并能減少血栓的形成。內源性TFPI-1活性降低可促進血栓形成〔12〕。研究發現，心肌梗死、冠狀動脈局部缺血等疾病中，血漿中TFPI-1水平較高，TFPI-1水平增高可抑制TF引起的血栓形成〔13〕。陳瑩等〔14〕研究結果表明，急性冠脈綜合征患者 TF、TFPI水平較穩定型心絞痛病人和對照組明顯增高，提示存在凝血機制異常。

本課題組前期研究發現oxHDL及其亞型可呈濃度和時間依賴性增加TF的表達，作用強弱不一，以oxHDL3的效應最顯著〔15〕。本實驗結果結合前期研究提示oxHDL及其亞型誘導血管內皮細胞表達TF、抑制TFPI-1可能是AS血栓形成的重要機制，而oxHDL3似在其中扮演著更重要的角色。脂蛋白氧化修飾后不僅影響血管內皮細胞TF的分泌，也可影響血管內皮細胞TFPI-1的表達;而TFPI-1作為重要的體內抗凝物質，其表達下降;對TF的抑制作用降低，體內抗凝/促凝平衡被打破，抗凝作用減弱，促進血栓的形成，從而可能加速了AS的進程。

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