自體骨髓間充質干細胞移植治療腦梗死后遺癥30例

詹三華 張魯峰 姚衛民 宋曉玲 劉林源 (武警河南省總隊醫院普內科，河南 鄭州 450052)

腦梗死后遺癥是腦血管疾病引起的一種頑固性疾病，對腦梗死后遺癥的病人，臨床治療應用中藥治療、針灸、理療等，療效甚微。隨著干細胞臨床應用技術的研究，通過干細胞移植治療腦梗死后遺癥，給腦梗死的治療帶來了突破性進展。本文重點研究自體骨髓間充質干細胞(BMSCs)經腰穿移植治療腦梗死后遺癥的療效和安全性。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 2010～2011年我院30例腦梗死后遺癥患者武警河南省總隊醫院普內科，年齡42～78歲，平均59歲;病程1.5～10.5年，平均4.5年。上述患者均經過頭顱CT和磁共振檢查確診。

1.2 術前準備 術前8 h禁食，4 h禁水，移植當日對患者進行隔離，骨髓穿刺術前5 h進行房間消毒。

1.3 骨髓采集 在無菌條件下，局部麻醉消毒，取髂后上棘為穿刺點，以30號骨髓穿刺針穿刺，抽骨髓140～190 ml，肝素抗凝。

1.4 BMSCs分離和培養 分離骨髓單個核細胞步驟如下：(1)用無菌接口機將采集骨髓采血袋和一個50 ml一次性無菌塑料血袋相連。(2)離心，2 400 r/min，5 min，將血漿轉移至50 ml一次性無菌塑料血袋內。(3)加入無菌PBS至紅細胞懸液內等倍稀釋。(4)將淋巴細胞分離液轉移至四聯袋主袋內。(5)等比例將稀釋的骨髓血緩緩加入盛有淋巴細胞分離液的主袋內，以1 900 r/min，離心20 min。(6)主袋內液體自上而下分為5層，白膜層轉移到另一成品袋內，此袋即為富集骨髓單個核細胞。(7)以2 500 r/min、離心5 min，生理鹽水重復洗滌2次。經上述步驟分離出骨髓單個核細胞，將細胞加入體積比DME∶F12為1∶1的DMEM/F12培養基裝于75 ml培養瓶中，置于37℃，飽和濕度體積分數為0.05的CO2培養箱內，細胞培養4 d，收集細胞，用生理鹽水懸浮4 ml，進行BMSCs移植術。分離的骨髓單個核細胞呈懸浮樣、小圓形，4 d后胞質豐富，核大且核仁明顯，克隆團樣生長，細胞數量明顯增多(圖1)。

1.5 移植方法 經腰穿注射至蛛網膜下腔(移植前，患者及家屬簽署治療同意書，該研究經醫院倫理委員會同意批準)。

1.6 療效標準 痊愈：生活自理或正常工作，運動恢復正常，肢體感覺及語言恢復正常，1年隨訪未復發;顯效：生活基本自理，運動、肢體感覺基本恢復，語言無障礙，1年隨訪未復發;好轉：生活部分自理，活動、肢體感覺有所改善，語言一定恢復，1年隨訪較穩定;無效：生活仍不能自理，治療前后癥狀無改善。

1.7 結果 總有效率86.7%，其中生活基本自理，體征和癥狀明顯改善11例，為顯效;生活部分自理，癥狀和體征有所改善15例，為好轉;4例體征和癥狀無變化，為無效。未見不良反應及并發癥發生。

圖1 BMSCs培養4 d(×200)

2 討論

腦梗死是導致成人殘疾第一位疾病，也是第三位導致人類死亡的疾病，僅次于心血管疾病和惡性腫瘤。我國每年發生腦梗死的病人在100萬人以上，其中約1/3的人失去勞動能力。腦梗死后遺癥使患者肢體殘疾，智力、語言障礙，成為嚴重的醫學難題和社會問題。腦梗死后遺癥的治療取決于兩個因素，第一、充分的發揮中樞系統的結構重構和功能重組，也就是中樞神經系統的可塑性;第二、梗死腦組織的吸收，側支循環的建立，血管再通。在一定條件下BMSCS能夠進行增殖，具有自我更新和多分化潛能，替代受損的神經細胞，達到治療腦梗死后遺癥的目的。

動物實驗表明，BMSCs大部分移行至缺血皮質邊緣〔1〕，而缺血對側相應部位BMSCs相對減少。側腦室中局部注射BMSCs，能夠遷移至缺血部位分化為神經元。BMSCs增加神經細胞的數量，能改善神經功能狀況，從而使腦梗死后遺癥得到改善。通過腦脊液移植有二種方法，第一、在CT定位下做第四腦室或側腦室穿刺注入的方法;第二、腰穿注射蛛網膜下腔。兩種方法在雙側大腦半球均發現干細胞蹤跡，BMSCs通過腦脊液的流動遷移到缺血損傷部位，使認知功能、語言功能，肢體運動功能明顯改善。BMSCs是治療腦梗死后遺癥的理想種子細胞，替代中樞神經系統疾病功能受損的神經元，促進神經功能恢復。用BMSCs治療腦梗死，生長因子、細胞因子增加和腦膠質細胞活化與神經功能的恢復相關〔1，2〕。BMSCs促進神經元的功能恢復和新的血管生成，同時血管內皮細胞促進神經干細胞增殖。BMSCs來自中胚層，主要存在于器官間質和全身結締組織，其中骨髓組織中含量最多，具有多向分化能力，可以分化為骨、肌肉、軟骨、神經等組織細胞〔3，4〕。BMSCs 擴增能力強免疫原性低，而且取材方便，具有多向分化潛能，合成細胞外基質，包括Ⅳ型膠原蛋白、白細胞介素(IL)-8、干細胞因子、集落刺激因子、神經營養因子、IL-11及造血調節分子等。IL-11對造血細胞和非造血細胞有多種作用，在中樞神經系統，其分布于齒狀回顆粒細胞層、海馬錐體細胞層、脊髓前角和側角神經元。BMSCs通過分泌各種細胞因子促進神經組織功能改善和神經系統自我修復〔5，6〕。

1 翁金森，劉 楠，杜厚偉，等.骨髓間充質干細胞移植對腦梗塞大鼠神經功能恢復及突觸素表達的影響〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2008;24(1)：34-7.

2 Yu X，Chen D，Zhang Y，et al.Overexpression of CXCR4 in mesenchymal stem cells promotes migration，neuroprotection and angiogenesis in a rat model of stroke〔J〕.J Neurol Sci，2012;316(1-2)：141-9.

3 Xu H，Miki K，Ishibashi S，et al.Transplantation of neuronal cells induced from human mesenchymal stem cells improves neurological functions after stroke without cell fusion〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(16)：3598-609.

4 Komatsu K，Honmou O，Suzuki J，et al.Therapeutic time window of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after cerebral ischemia〔J〕.Brain Res，2010;1334：84-92.

5 Toyama K，Honmou O，Harada K，et al.Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia〔J〕.Exp Neurol，2009;216(1)：47-55.

6 Ikehara S.Bone marrow transplantation：a new strategy for intractable diseases〔J〕.Drugs Today(Barc)，2002;38(2)：103-11.