半合成-酶連法克隆EFsec基因及其初步表達分析

李 麗 朱貴明 汪坤福 張鵬霞 (佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

硒蛋白(selenoprotein)是一類含有硒代半胱氨酸(selenocysteine，Sec)的特殊蛋白質，廣泛存在于各種生物中。在哺乳動物中，硒蛋白不僅是硒的主要存在形式，也是主要的生物學功能形式。硒蛋白在抗氧化、抗腫瘤和調節免疫等方面都有顯著的作用〔1～3〕，硒蛋白尤其是哺乳動物硒蛋白的生物合成機制十分復雜，因為Sec的編碼密碼子(UGA)就是正常情況下的終止密碼子，其解碼需要一系列復雜的反式作用因子以及順式作用元件的相互作用才得以完成;而且，硒蛋白的翻譯效率很低〔4，5〕。Efsec，即真核硒代半胱氨酸-tRNA 特異性延伸因子是其中一個重要的反式作用因子，推測其在細胞質中先與硒代半胱氨酸-tRNA結合，因為Efsec具有核定位序列(NLS)，故能夠攜帶硒代半胱氨酸-tRNA進入細胞核，然后再與其他反式作用因子共同作用，將硒蛋白中編碼硒代半胱氨酸的密碼子UGA進行解碼〔6～8〕。為了深入研究Efsec在UGA解碼中的作用以及提高硒蛋白的基因工程表達效率，本文采用酶連-半合成法克隆EFsec基因并將其連入哺乳動物表達載體pcDNA3.1，然后轉染哺乳動物細胞HEK293T進行初步表達分析，為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌 TOP10、HEK293T細胞和質粒 pcDNA3.1(-)為本實驗室所保存。限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Pfu高保真酶、RT-PCR試劑盒等均購于寶生物工程(大連)有限公司。質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒等均購于天根生化科技(北京)有限公司。轉染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產品。細胞培養所用培養基、血清、培養皿等為Hyclone產品。

1.2 方法

1.2.1 Efsec基因的拼接策略和設計 質粒pOTB7-EFsec為本實驗保存。質粒中插入目的基因EFsec來源于人的cDNA(GenBank ACCESSION No.BC007933)，克隆位點為EcoR I和Xho I。但該基因在5'端缺失一小段編碼的堿基序列，約90 bp，需要補齊才具有正常的功能。經過酶切位點分析發現，在該基因的5'端存在一個天然酶切位點BssHⅡ，因此將缺失的約90 bp的序列(實際上包括20 bp的錯誤序列)連同其后的約100 bp的序列通過人工合成，這樣獲得一段總長約190 bp的人工合成的基因片段。合成的基因片段通過BssHⅡ酶切位點與缺失的Efsec基因片段(命名為Efsec-)相連接而補齊，即可獲得完整的Efsec基因。見圖1。

圖1 Efsec基因拼接策略和設計

1.2.2 基因片段的合成、拼接與克隆 190 bp的基因片段委托北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，合成的基因片段克隆到pMD18-T載體。合成的190 bp片段用SphⅠ和BssHⅡ從pMD18-T中切下來，而Efsec-基因片段從pOTB7-EFsec質粒中用BssHⅡ和BglⅡ切下來(大小為2 000 bp，含3'UTR)，然后將兩者做連接，再以連接產物為模板采用PCR方法擴增出ORF序列。擴增時使用的PCR引物已加酶切位點(BamHⅠ，EcoRⅠ)：上 游 引 物 LefsecR-2：5'ACTGGATCCATTATGGCAGGGCGGCGGGTG 3';下游引物 LefsecR-α：5'TGCGAATTCTGGGGGAGGTCACCGGACACTC 3'。經過酶切后可連接到真核表達載體pcDNA3.1(-)，從而獲得該基因的表達質粒pcDNA3.1-EFsec。該質粒經測序驗證是否符合預期，確保未發生突變。上述有關酶切、連接、轉化、質粒提取、PCR等主要參照《分子克隆》中的方法進行。

1.2.3 重組質粒有效性初步鑒定 在完成基因拼接和pcDNA3.1-Efsec質粒構建后，為了初步檢驗該質粒的有效性，采用脂質體(瞬時)轉染的方法轉染HEK293T細胞，在轉染后第3日收集細胞，提取總RNA，并以RT-PCR方法檢測Efsec情況，PCR 引物為 Efg-s：5'CTTTGACAAGCAGCCGCAGAG 3'和 Efg-a：5'TGGGATGGAAATCTGGGACG 3'，擴增產物大小為540 bp。

2 結果

2.1 190 bp基因小片段的合成及其與EFsec－基因片段的拼接、克隆 190 bp基因小片段合成后連入pMD18-T載體，經過測序驗證無誤。然后按照上述實驗方法將該基因片段以及EF-sec-基因片段分別切下來，連接，并使用LefsecR-s和LefsecR-a引物擴增。PCR擴增時使用了Teq酶和Pfu酶分別進行實驗，只有Pfu酶擴增獲得良好結果。擴增的產物為完整EFsec基因的編碼框部分，大小約1 800 bp(圖2A)。PCR產物經過回收、酶切，連接到pcDNA3.1(-)載體，轉化大腸桿菌TOP10后涂板，將長出的細菌克隆隨即挑選數個用以鑒定重組質粒，將其中4個提取質粒做大小鑒定，均為陽性克隆(圖2B);再從這4個質粒中取3、4號做酶切鑒定，再次確認為重組克隆(圖2C)，最后經測序證明這兩個克隆完全正確并無突變產生(圖3)。

圖2 pcDNA3.1-EFsec表達質粒的構建

2.2 通過轉染HEK293T細胞初步鑒定重組質粒的有效性將pcDNA3.1-EFsec表達質粒用于轉染，轉染時利用 pcDNA3.1-GFP質粒進行對照，其綠色熒光可比較準確地反映轉染效率。轉染后第2天觀察細胞，結果表明轉染實驗是成功的(圖4)。然后收集細胞提取總RNA做RT-PCR實驗，結果表明轉染pcDNA3.1-EFsec質粒的細胞中EFsec基因發生了大量的表達，而正常HEK293T細胞以及pcDNA3.1-GFP對照轉染的細胞則未能檢測到EFsec基因發生了大量的轉錄表達。這就意味著該基因在培養條件下的細胞中是不表達的，但其重組質粒轉染后則發生強制性的表達，說明成功構建表達質粒。

圖3 pcDNA3.1-Efsec重組質粒的測序鑒定(局部)

圖4 pcDNA3.1-EFsec重組質粒有效性鑒定

3 討論

EFsec在Sec通過特殊翻譯機制參入到硒蛋白的過程中起著重要作用，是Sec的編碼密碼子UGA正確解碼的一個關鍵的反式作用因子〔6，8〕。而本實驗室所保存的pOTB7-EFsec質粒中插入的EFsec-由于缺失一段堿基而并不是一個完整的功能正常的基因，因此在研究EFsec基因在硒蛋白生物合成中的作用機制前需要將它補齊。對于較短的基因片段，采取人工合成是優先選擇，既快捷又經濟。那么基因片段如何破解呢?很多實驗的做法是采取退火方法，使相互有局部重疊的兩個片段在退火時完成拼接。這種辦法發生錯配的概率不小，會造成一些突變，從而需要修正，甚至是反復的修正。本研究的策略是利用基因序列中突然存在的酶切位點來拼接基因片段，這種方式可以說不存在拼接中發生突變的可能，而且也是比較方便快捷的方法。在確定拼接酶切位點時需要注意的是應該選擇離拼接一段盡可能近的位點，并且選擇常用的限制性內切酶。酶連后采用PCR擴增的方法也是本實驗中證明極其有效迅速的方法，當然必須要選擇高保真酶，確保PCR擴增不出現突變。

將連接后的PCR擴增產物即完成拼接的EFsec基因片段連接到真核表達載體pcDNA3.1(-)獲得正確的重組質粒后，本研究將其轉染了哺乳動物細胞HEK293T，用以驗證基因及其重組質粒的有效性，結果發現本來在正常培養條件下的HEK293T細胞中不表達的EFsec基因獲得了強制性表達，說明表達載體構建是成功的。另外，在正常培養條件下HEK293T細胞中不表達EFsec基因，這正好說明EFsec的特殊性，即它完全是為硒蛋白的合成而存在的。實際上，硒蛋白的合成必須要在硒元素存在時才發生，而體外培養細胞時缺乏硒元素〔9〕。這就說明，硒可能直接或間接地調節EFsec的表達。總之，本研究提供了一種有效的、準確快捷的基因拼接策略和方法，克隆了功能完善的EFsec基因并進行了初步表達分析，為下一步的研究奠定了基礎。

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