腫瘤壞死因子－α增加腎入球動脈平滑肌細胞胞內鈣離子濃度的機制

金旭鵬 郭蓮怡 (遼寧醫學院基礎學院，遼寧 錦州 121000)

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是單核-巨噬細胞產生的具有多種生物活性的細胞因子，參與抗感染、發熱、休克等多種病理生理過程〔1〕。TNF-α也是引起重癥肝病發生發展的重要因子〔2〕。肝腎綜合征(HRS)是繼發于重癥肝病的腎衰竭，多種因素參與其發病〔3〕。腎血管收縮引起的腎血流量銳減是HRS的主要發病因素。腎血流量受腎小球入球小動脈收縮和舒張的控制，而腎入球動脈平滑肌細胞(RASMCs)內Ca2+水平高低與腎入球動脈的舒縮功能直接相關。本研究觀察TNF-α對RASMCs內鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 200～250 g普通級雄性SD大鼠(由遼寧醫學院實驗動物中心提供)，許可證號：SCXK(遼2003-0007)，開放系統飼養，實驗前禁食12 h。進行原代RASMCs的分離與培養。

1.2 主要試劑 Fluo-3/AM乙酰甲酯、TNF-α、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)、內皮素(美國 Sigma公司)、PSS緩沖液(PSS：0.1 mmol CaCl2，125.0 mmol NaCl2，5.0 mmol KCl，1.0 mmol MgCl2，10.0 mmol Glucose，20.0 mmol HEPES)。

1.3 主要實驗器材 CK30-12PHP相差顯微鏡，日本OLYMPUS;JEM-1200EX電鏡，日本;激光共聚焦顯微鏡(Uitma212型)，Meridina公司;MetaFlour4.5軟件，德國Carl Zeiss公司。

1.4 方法

1.4.1 參照文獻〔4〕行大鼠RASMCs的分離與培養 戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，摘除腎臟，留取皮質，應用篩網和酶消化法分離RASMCs，最后加入完全營養液，并以1×104細胞數接種于25 cm2培養瓶內，于CO2孵箱中培養，前3 d每天換液，以后隔天換液，1 w后可行細胞傳代。相差顯微鏡觀察細胞生長情況，取3～10代細胞用于實驗。

1.4.2 RASMCs電鏡標本制備 培養瓶中細胞生長至單層融合后，加1 ml胰酶消化、吹打，將細胞收于1 ml EP管中，1 500 r/min 4℃ 離心 4 min，棄上清，小心加入 1 ml PBS，1 500 r/min 4℃離心4 min，棄上清，小心加入1 ml 2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，常規丙酮脫水，經浸透、樹脂包埋、超薄切片，醋酸鈾染色，JEM-1200EX電鏡觀察。

1.4.3 實驗分組 TNF-α處理(0 h，24 h)分2組：ET刺激組(A1)：實驗中加入 ET(100 nmol/L)刺激，不加 TNF-α;TNF-α +ET 刺激組(A2)：實驗前24 h 加入 TNF-α(100 μg/L)，實驗中加入 ET(100 nmol/L)刺激。2-APB阻斷分2組：2-APB+ET刺激組(B1)：加 ET前10 min加入2-APB，實驗中加入ET(100 nmol/L)刺激;TNF-α+2-APB+ET刺激組(B2)：實驗前24 h加入 TNF-α(100 μg/L)，加 ET前 10 min加入 2-APB(30 μmol/L)，實驗中加入 ET(100 nmol/L)刺激。

1.4.4 細胞內鈣離子濃度的測定〔5〕各組細胞均加入鈣離子熒光探針Fluo-3/AM(5 μmol/L)，Fluo-3/AM可以和鈣離子結合，產生較強的熒光，采用confocal顯微鏡測定單個活細胞內Ca2+熒光強度(發射波長505 nm，激發波長488 nm)。動態觀察各組細胞胞內鈣熒光強度(FI)的變化。采用LSM510軟件對數據、圖形進行實時動態測量與分析，根據給藥前后單個細胞的FI值計算出細胞內〔Ca2+〕i。每組設2個平皿，并用不同代細胞重復3次。依據Grynkiewicz公式，計算〔Ca2+〕i。

1.5 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件分析，計量數據以s表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 RASMCs的鑒定 原代培養的RASMCs大小不等，形狀多樣，呈梭形或者三角形等形狀;傳代培養的RASMCs形態多呈梭形或者長梭形。透射電鏡見細胞胞質內大量縱行束樣分布的肌絲，上述結果表明所獲細胞為RASMCs。見圖1。

圖1 RASMCs的生長情況

2.2 RASMCs內〔Ca2+〕i的測定 各組細胞加ET刺激前，即靜息狀態下〔Ca2+〕i無顯著差異(P＞0.05)，亦未發生自主性上升，只是因指示劑的衰減，熒光強度略有遞減的趨勢。加ET刺激后，A1組RASMCs在短時間內(約1 min)鈣離子濃度迅速、顯著增加(即峰值升高相)，與加 ET前比較有顯著差異(P＜0.01);A2組RASMCs內〔Ca2+〕i上升明顯增強，與 A1組比較差異顯著(P＜0.01)。B1及B2組RASMCs內〔Ca2+〕i無明顯變化，與加ET前比較無顯著差異(P＞0.05);與A1組加ET后比較差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 各組RASMCs內〔Ca2+〕i的變化( s，nmol/L)

表1 各組RASMCs內〔Ca2+〕i的變化( s，nmol/L)

與加ET前比較：1)P＜0.01;與A1組加ET后比較：2)P＜0.01

組別 加ET前(靜息狀態)加ET后A1 109.51±52.63 240.36±56.781)A2 128.07±78.56 375.45±60.392)B1 112.69±57.76 101.66±48.032)B2 126.61±83.92 116.35±53.482)

3 討論

HRS是重型肝炎和嚴重肝病最常見的并發癥〔6〕。腎入球動脈平滑肌的舒縮對于腎皮質血流量的調節具有直接作用。本研究探討TNF-α對RASMCs收縮及胞內Ca2+的影響。應用酶消化及篩網技術提取RASMCs，并進行原代培養，通過透射電鏡觀察胞質內的肌絲證實已成功分離培養RASMCs。

當HRS發生時，患者血清中內皮素等多種縮血管活性物質水平明顯增高，并可直接或通過間接途徑引起腎血管收縮，是導致腎血流灌注和腎功能紊亂的重要介質。血管平滑肌的舒縮直接受細胞內Ca2+水平的影響〔7〕，高濃度Ca2+可引起細胞收縮，低濃度Ca2+可引起細胞舒張，因此監測細胞內〔Ca2+〕i變化能反映細胞的舒縮狀態。最近的實驗研究發現，許多細胞因子可以使細胞內Ca2+水平增高，使效應細胞發生生物反應〔8〕。本實驗結果說明 TNF-α可使內皮素刺激后的胞內〔Ca2+〕i增高。

1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)是平滑肌細胞內主要的Ca2+釋放通道，當某些縮血管活性物質作用于細胞膜上的相應受體后，細胞內出現高水平的IP3，增高的IP3與IP3R結合，導致細胞內儲備Ca2+釋放，結果使效應細胞發生生物反應〔9〕。當HRS發生時，許多縮血管活性物質(如內皮素、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素、血栓素A2、白三烯等)明顯增高〔10〕，作用于平滑肌細胞，引起胞內IP3水平增高，而致腎血管收縮。本研究結果顯示，TNF-α增強內皮素刺激引起胞內Ca2+釋放的作用可被2-APB阻斷。故認為TNF-α間接影響胞內〔Ca2+〕i，是通過IP3R來起作用的。綜上所述，內皮素刺激可使RASMCs在短時間內胞內〔Ca2+〕i迅速、顯著增加。TNF-α作用后上述效應明顯增強，且此效應可被2-APB阻斷，證明了TNF-α可增強內皮素刺激引起的胞內鈣離子釋放進而增強細胞收縮，引起腎小球入球小動脈收縮，腎血流量減少，腎小球濾過率降低，參與HRS發生。上述研究不僅證明內皮素是通過激動IP3R而產生效應的;也證明了TNF-α可增強內皮素刺激引起的胞內Ca2+釋放，且這一作用也是通過IP3R來調節的。

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