金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰老小鼠肝、腎、腦組織的抗氧化作用

袁丹華 屈海琪 蔣 偉 楊國棟 安 芳 王書華 (河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有清熱解毒，消腫明目的功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎、急性腸炎、泌尿系統(tǒng)感染等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金蓮花主要有效成分為黃酮類化合物〔1〕，前期研究表明，金蓮花黃酮中含量較高的是葒草苷和牡荊苷〔2〕，金蓮花總黃酮及其單體葒草苷和牡荊苷具有體外抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用〔3～6〕，藥代動力學研究表明葒草苷與牡荊苷在不同種屬動物組織的分布均沒有差異，腎臟中濃度最高，其次是肝，腦中含量最少〔7，8〕。有關金蓮花黃酮葒草苷和牡荊苷的體內抗氧化作用尚未見報道，通過比較葒草苷和牡荊苷的體內抗氧化作用，以期篩選出抗衰老作用最佳藥物的構效關系，為抗衰老藥物的研究提供新的動力。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 野生金蓮花采自河北省張家口沽源，經(jīng)我院藥物研究所鑒定為短瓣金蓮花 ;葒草苷和牡荊苷(自制，經(jīng)1H－NMR和HPLC鑒定純度98.9%);D-半乳糖(D-gal)，分析純，上海試一化學試劑有限公司;牛血清蛋白，分析純，鄭州益康有限公司;硫酸奎寧，分析純，上海齊奧化工有限公司;5，5-雙硫代對硝基苯甲酸，分析純，上海試一化學試劑有限公司;還原性谷胱甘肽，純度≥99%，國藥集團化學試劑有限公司;磷酸鈉，分析純，天津化工有限公司;鉬酸銨，分析純，天津化工有限公司鄰苯三酚，分析純，上海邦辰試劑有限公司;生理鹽水，石家莊第四制藥廠;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px、丙二醛(MDA)測定試劑盒，均購買自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 健康的昆明種小鼠120只(雌雄各半)，河北北方學院動物中心提供(許可證號：SCXK京2004-0001)，分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃。

1.3 儀器 U-3900紫外可見分光光度計(日本);ME235S十萬分之一電子天平(日本);DK-8型電熱恒溫水槽(上海精密實驗設備有限公司);低溫高速離心機(賽多利斯公司);HQ-60型旋渦混合器(北方同正生物技術發(fā)展公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模方法 采用D-gal致亞急性衰老法，正常組注射等體積生理鹽水，造模時間為8 w，每天稱重1次，依據(jù)末次稱重的克數(shù)調整給藥劑量。

1.4.2 模型驗證 造模第6周和第8周分別選取正常組和造模組小鼠(備用)8只，摘眼球采血，分離血清，測定總抗氧化能力(T-AOC)、SOD含量，以驗證小鼠衰老情況。第8周末，造模組小鼠指標與正常組相比具有統(tǒng)計學意義，顯示模型復制成功。

1.4.3 藥物配制 葒草苷和牡荊苷溶液的配制：N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水 =1∶1∶20。

1.4.4 給藥與分組 造模成功后，實驗分為模型組、正常組、維生素E對照組、葒草苷和牡荊苷高、中、低各三個劑量組，各治療組從第9周開始每日上午分別口服灌胃給藥，模型組和正常組給等體積的生理鹽水，每日一次。確定葒草苷和牡荊苷高、中、低劑量分別為 40、20、10 mg/kg，維生素 E 對照組每日20 mg/kg。每日稱重一次，依據(jù)小鼠每次的體重調整給藥劑量，給藥時間8 w。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 小鼠一般狀態(tài)的觀察 觀察各組小鼠一般狀態(tài)，如攝食、飲水情況、體重、活動度、毛色、光澤度變化等方面，并相互進行比較。

1.5.2 小鼠組織中 SOD、CAT、GSH-Px、MDA的測定 給藥8 w后小鼠斷頭處死，冰浴條件下迅速取出腎、肝、腦組織，精確稱量，用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心得上清液。取1.0 ml的上清液，加入1.0 ml乙醇-氯仿混合液，震蕩2 min，4 000 r/min離心5 min以除去蛋白質，取上清液按試劑盒說明操作，測定SOD、CAT、GSH-Px的活性及MDA。

2 結果

2.1 金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-gal致衰老小鼠一般形態(tài)的影響 正常組小鼠飲食正常，活潑好動、毛發(fā)光亮、濃密，皮膚彈性良好。模型組小鼠在造模后，逐漸表現(xiàn)出少動，行動遲緩，喜蜷縮，毛色發(fā)黃，尤其是腹部毛發(fā)逐漸變得無光澤、稀疏并漸有脫毛現(xiàn)象，皮膚松弛，彈性下降。而各治療組在服用相應的藥物后，總體狀態(tài)好于模型組。

2.2 葒草苷和牡荊苷對D-gal致衰老小鼠腎肝腦組織中SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響結果 見表1、表2。與正常組相比，模型組小鼠腎、肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px含量明顯降低，MDA明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。與模型組相比，葒草苷和牡荊苷各治療組均具有提高小鼠組織 SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。與維生素E對照組相比，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組提高小鼠肝、腦、腎組織SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用較弱，具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與維生素E組相比無顯著性差異。葒草苷中、低劑量組提高小鼠腎、肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用高于牡荊苷中、低劑量組，具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷與牡荊苷的高劑量組無顯著性差異。

表1 各組肝、腎、腦組織SOD、CAT水平( s，n=10)

表1 各組肝、腎、腦組織SOD、CAT水平( s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，與維生素E組比較：2)P＜0.05;與葒草甘中劑量組比較：3)P＜0.05;與葒草甘低劑量組比較：4)P＜0.05，下表同

組別 SOD(U/ml)腎肝腦CAT(U/ml)腎肝腦.915 6.625±0.826 6.025±0.908模型組 45.21±7.05 34.40±7.59 41.02±6.07 4.521±0.705 2.940±0.759 2.802±0.607維生素E組 80.36±6.681) 68.36±8.241) 88.36±6.971) 7.236±0.6681) 6.136±8.241) 5.736±0.6971)葒草甘高劑量組 89.76±6.021)2) 71.24±7.821) 67.36±7.121) 7.476±0.6021)2) 6.204±0.7821) 5.836±0.7121)葒草甘中劑量組 80.36±7.591) 60.23±7.061)2) 54.36±7.041)2) 6.236±0.7591) 5.230±0.7061)2) 4.936±0.7041)2)葒草甘低劑量組 68.32±6.341)2) 50.14±8.071)2) 43.36±6.891)2) 5.132±0.6341)2) 3.714±0.8071)2) 4.160±0.6891)2)牡荊苷高劑量組 72.24±6.861)2) 64.01±7.721)2) 58.36±8.011)2) 7.024±0.6861)2) 5.9181±0.6721)2) 5.536±0.8011)2)牡荊苷中劑量組 66.36±7.061)2)3) 56.68±7.911)2)3) 48.36±5.981)2)3) 5.236±0.7061)2)3) 4.068±0.7911)2)3) 4.436±0.5981)2)3)牡荊苷低劑量組 60.36±6.591)2)4) 42.68±8.121)2)4) 43.36±6.131)2) 3.836±0.6591)2)4) 3.268±0.8121)2)4) 3.636±0.6131)2)正常組 104.08±9.15 92.17±8.26 110.24±9.08 8.208±0

表2 各組肝、腎、腦組織GSH-Px、MOA水平( s，n=10)

表2 各組肝、腎、腦組織GSH-Px、MOA水平( s，n=10)

組別 GSH-Px(U/ml)腎肝腦MDA(U/ml)腎肝腦4 14.52±3.26 8.48±2.37模型組 18.39±1.65 17.98±1.15 8.37±1.43 29.68±2.36 24.25±2.54 15.97±3.36維生素E組 32.10±2.041) 30.51±1.671) 14.25±2.071) 18.53±3.271) 17.52±3.141) 10.26±2.011)葒草甘高劑量組 33.42±1.961) 29.88±1.161) 13.34±1.691) 19.10±3.091) 16.35±2.581) 11.22±3.761)葒草甘中劑量組 30.24±1.041) 26.32±1.181)2) 12.40±1.371)2) 21.56±2.541) 18.71±2.021) 12.25±2.631)葒草甘低劑量組 26.21±1.941)2) 22.93±1.201)2) 10.56±2.141)2) 24.65±3.651)2) 20.32±4.011)2) 13.69±3.591)2)牡荊苷高劑量組 32.46±1.021) 27.57±0.941) 13.02±2.031) 20.46±2.581) 17.34±3.611) 11.97±3.241)牡荊苷中劑量組 25.26±1.651)2)3) 23.16±1.061)2)3) 11.93±1.971)2) 22.87±3.521)2) 19.24±2.971) 13.01±3.061)牡荊苷低劑量組 20.64±1.291)2)4) 19.94±1.681)2)4) 10.96±1.211)2) 25.36±2.831)2) 21.04±2.431)2) 13.89±2.521)2)正常組 34.56±1.12 32.46±1.10 16.58±2.05 15.17±3.6

3 討論

D-gal亞急性衰老模型是研究抗衰老藥物的經(jīng)典模型。D-gal在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，而后者不能被細胞進一步代謝，進而造成細胞代謝紊亂，破壞并消耗機體抗氧化物質，并不斷產生自由基，導致組織細胞受損，使細胞腫脹、功能障礙，從而造成實驗性亞急性衰老模型。

在正常代謝情況下，機體產生和清除自由基處于一種動態(tài)平衡中。內源性的清除自由基的酶系有SOD、CAT、GSH-Px等，外源性的清除劑有維生素E、維生素C以及從植物提取出的黃酮類等化合物。T-AOC主要維持內環(huán)境活性氧自由基的動態(tài)平衡，清除濃度過高的活性氧自由基，使機體處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，它可代表抗氧化酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)的變化。SOD可以催化超氧陰離子自由基的歧化反應，產生破壞能力相對較低的H2O2，而CAT和 GSH-Px能將H2O2分解成H2O和O2，減輕或阻斷脂質過氧化作用的一級引發(fā)作用，保護機體免受過氧化氫的侵害，延緩細胞的衰老，從而預防自由基導致的疾病的發(fā)生〔9，10〕。根據(jù)自由基學說，適當補充外源性自由基清除劑，增強肌體自由基防御系統(tǒng)能力，即可達到抗衰老的目的。MDA是氧自由基引起細胞脂質過氧化損傷的終產物，是極其活潑的交聯(lián)劑，能與蛋白質、核酸等交聯(lián)，從而使其變性甚至失活，MDA可反映機體內過氧化程度，間接反映出細胞的受損程度〔11〕。

本實驗結果表明葒草苷和牡荊苷在提高機體內SOD、CAT、GSH-Px的活性方面發(fā)揮較好的作用，且葒草苷和牡荊苷均能降低組織內的MDA的含量，提示葒草苷和牡荊苷可能通過直接清除體內氧自由基，激活抗氧化酶系的防御系統(tǒng)等作用，提高機體的抗氧化能力，減少自由基對機體的損傷，從而起到延緩衰老的作用。其中葒草苷中、低劑量組提高機體抗氧化酶和降低組織MDA的作用分別比牡荊苷中、低劑量組的作用強，這與文獻所說B環(huán)上連有一個酚羥基的黃酮抗氧化性比B環(huán)上具有鄰二酚羥基的黃酮抗氧化活性要弱些相一致〔12〕。高劑量組與維生素E作用相當。

從中醫(yī)理論角度上說，腎藏象在中醫(yī)臟腑中占有重要的地位，所謂腎氣絕，則不盡其天命而死也;天壽過度，氣脈常通，而腎氣有余也〔13〕。腎在抗衰老作用中起著巨大的作用，金蓮花黃酮類單體藥代動力學理論證明金蓮花黃酮單體葒草苷和牡荊苷，在腎中濃度最高，可見金蓮花黃酮類單體具有很大的研究價值，也為進一步研究的抗氧化作用打下了堅實的基礎。本文通過對葒草苷和牡荊苷的藥理學研究，從中醫(yī)的角度證明其具有提高機體的抗氧化抗衰老的能力。

1 李良千.毛茛科金蓮花亞科植物的地理分布〔J〕.植物分類學報，1995;33(6)：535-7.

2 曲彩紅，顏 娟，田嘉銘，等.HPLC測定金蓮花中三種黃酮苷的含量〔J〕. 中成藥，2010;32(3)：162-4.

3 顏 娟，胡海娜，田嘉銘，等.金蓮花中總黃酮抗氧作用的研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2010;26(2)：20-2.

4 楊國棟，饒 娜，田嘉銘，等.金蓮花中葒草苷和牡荊苷的抗氧作用研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2011;22(9)：110-1.

5 孫 黎，劉 芳，劉 華，等.金蓮花黃酮對人乳腺癌細胞作用的研究〔J〕.中國老年學雜志，2010;29(9)：1098.

6 孫 黎，羅 強，張 力，等.金蓮花黃酮對A549細胞生長及凋亡的影響〔J〕. 中國老年學雜志，2011;131(2)：82-3.

7 曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內藥代動力學研究〔D〕.河北北方學院.優(yōu)秀碩士學位論文，2010.

8 顏 娟.金蓮花中牡荊苷兔體內藥代動力學研究〔D〕.河北北方學院.優(yōu)秀碩士學位論文，2010.

9 Wang H，Joseph JA.Structure-activity relationships of quercet in antagonizing hydrogenperoxide-induced calciumdysregulat ion in PC 12 cells〔J〕.Free Radical Biol Med，1999;27(5-6)：683-94.

10 桑 琛，李明學.衰老自由基學說和運動對抗自由基損傷的作用〔J〕. 吉林體育學院學報，2007;23(7)：80-1.

11 Gawel S，Wardas M，Niedworok E，et al.Malondialdehyde(MDA)as a lipid peroxidation marker〔J〕.Wiad Lek，2004;57(9-10)：453-5.

12 李順成.衰老實質及中醫(yī)方藥延緩衰老機理研究思路〔J〕.中國中西醫(yī)結合雜志，1993;13(6)：1371-3.

13 程 革.金匾腎氣丸延緩衰老作用的理論和實驗研究〔D〕.南京中醫(yī)藥大學，2008.