潑尼松龍對脂多糖誘導的BV2細胞NO、iNOS及p38表達的影響

王 丹 徐德軍 樸花子 (延邊大學基礎醫學院，吉林 延吉 33002)

小膠質細胞在老年性癡呆、帕金森病等中樞神經系統退行性疾病中有重要作用〔1～4〕，是廣泛分布于中樞神經系統(CNS)的一類重要免疫效應細胞，在維持神經元生存和生命活動中起著重要作用，它具有免疫和炎癥的雙向調節功能。脂多糖(LPS)即內毒素，是革蘭陰性菌的主要致病成分，當LPS攻擊巨噬細胞時，可激活巨噬細胞內p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路，促使誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等表達增加，產生大量NO，參與炎癥反應。潑尼松龍是中效腎上腺皮質激素藥，屬于甾體類抗炎藥。對多種原因所致的炎癥反應(如感染性炎癥、物理性炎癥、化學性炎癥、免疫性炎癥及無菌性炎癥)均有效，所以臨床上廣泛應用于各種原因所致的過度炎癥性疾病，如過敏性疾病、嚴重細菌感染、腫瘤治療、器官移植免疫排斥反應及對糖皮質激素敏感的眼部炎癥等。BV2細胞屬于小膠質細胞株，本實驗觀察p38 MAPK信號通路在潑尼松龍干預后NO、磷酸化p38(p-p38)及iNOS蛋白表達變化和iNOS mRNA表達變化中的調控作用，來探討其在LPS所致的小膠質細胞炎癥反應中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 潑尼松龍與LPS均為美國Sigma公司產品，細胞培養液DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)和TRIZOL試劑為美國 Gibco公司產品。p38 MAPK、P-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、iNOS 抗體為 Santa Cruz公司產品，小鼠BV2小膠質細胞株由韓國梨花女子大學神經科學研究所提供。

1.2 細胞培養 小鼠小膠質細胞株BV2用含10%小牛血清的DMEM培養液(含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)培養，37℃，5%CO2恒溫箱培養，細胞單層生長，達80%左右時傳代。細胞接種到培養板后均孵育過夜，潑尼松龍在LPS使用前1 h加入。

1.3 分組與處理 細胞接種于48孔培養板(3.5×105細胞/ml，0.2 ml/孔)12 h后實驗。實驗分為空白對照組、LPS(100 μg/L)組、潑尼松龍(10、20、30 μmol/L)組和 LPS 加潑尼松龍組，繼續培養24 h后，Greiss法測定培養液中NO含量。

1.4 iNOS mRNA測定 細胞接種于60 mm培養皿(2×106細胞/ml)中培養12 h后，分別添加潑尼松龍 (10 μmol/L)和LPS(500 μg/L)。繼續培養6 h，按說明書用Trizol試劑抽提RNA，計算總RNA濃度，取總RNA 2 μg進行逆轉錄。再以逆轉錄反應液2 μl作為模板，加入相應引物(β-actin內參照)進行PCR擴增，總反應體積50 μl。所用iNOS引物序列上游引物5'-TCA CTG GGA CAG CAC AGA ATG-3'，下游引物 5'-AAC TGG GTG AAC TCC AAG GT-3'，擴增產物684 bp;β-actin上游引物5'-TGA ACC CTA AGG CCA ACC-3'，下游引物5'-CCA CAG GAT TCC ATA CCC-3'，擴增產物489 bp。PCR條件為94℃預變性4 min，94℃變性 45 s，53℃復性 45 s，72℃延伸 45 s，30 個循環，最后72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖電泳PCR擴增產物，Quantity One軟件分析二者PCR產物光密度值，以目的mRNA與內參β-actin的RT-PCR產物光密度比值作為目的mRNA相對表達量。

1.5 Western印跡法測定BV2細胞iNOS和p-p38蛋白表達細胞接種于6孔培養板(9×105細胞/ml)，分別添加潑尼松龍(10 μmol/L)和 LPS(500 μg/L)。細胞培養 24 h 后，用冰冷的PBS終止刺激并洗滌細胞2次，用細胞刮子將細胞刮下，按說明書提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠和10%分離膠)、轉膜、5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別添加抗iNOS、P-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK 和(或)抗 β-actin一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜、加辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液(1∶2 000)，37℃下孵育1 h，化學發光法顯影，用圖像分析系統分析目標帶光密度值，以目的蛋白與內參β-actin蛋白光密度比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 潑尼松龍對LPS誘導NO含量的影響 細胞培養液中添加 LPS(100 μg/L)和潑尼松龍(0.1、1、10 μmol/L)處理細胞后培養24 h。LPS組與空白對照組比較，NO含量高達404%，而潑尼松龍可明顯抑制由LPS誘導NO分泌，各劑量潑尼松龍組NO含量分別為292%、176%、115%，有劑量依賴性，潑尼松龍1、10 μmol/L組與LPS組比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 潑尼松龍對LPS誘導的iNOS表達影響 無LPS刺激情況下BV2細胞不表達iNOS基因，同時單純潑尼松龍對iNOS表達無影響。但是用LPS刺激后，BV2細胞iNOS mRNA和蛋白表達顯著增高，而潑尼松龍明顯抑制LPS誘導的BV2細胞iNOS mRNA和蛋白表達，而且明顯低于單獨使用LPS組(圖1)。

2.3 潑尼松龍對LPS誘導的P-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK蛋白表達的影響 用LPS刺激后，BV2細胞P-p38和p-ERK1/2表達顯著增高，而潑尼松龍明顯抑制LPS誘導的BV2細胞P-p38的表達，而對p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK表達沒有明顯影響(圖2)。

圖1 潑尼松龍對LPS誘導小膠質細胞的iNOS mRNA(A)和iNOS蛋白(B)表達的影響

圖2 潑尼松龍對LPS誘導的小膠質細胞P-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK蛋白表達的影響

3 討論

某些病理條件下，如感染、外傷、缺血、毒性物質侵害等情況下，小膠質細胞可被激活，活化后的小膠質細胞在腦內充當第一道防線，調節與免疫相關的某些分子表達，釋放細胞因子和趨化因子等，同時發揮機械吞噬功能，吞噬入侵的病原體、有害物質及死亡的神經細胞殘骸核，對神經元起到一定保護作用;而另一方面，小膠質細胞長期持續活化，會分泌一系列毒性物質和前炎性因子，如氧自由基、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、NO等。這些物質與小膠質細胞活化互為因果，相互作用，使CNS炎癥反應放大、毒性產物進一步增多，導致相應腦區神經元變性壞死，從而引起相應疾病。目前，已經公認的是某些神經退行性疾病發生與中樞神經系統炎癥反應密切相關，例如阿爾茨海默病、多發性硬化和創傷后腦缺血損傷等疾病都與炎癥相關。持續活化的小膠質細胞產生大量 NO、TNF-α、IL-β、自由基等致炎因子和細胞毒性因子，從而引發中樞神經系統炎癥反應，這種炎癥反應是神經變性疾病發展中的早期主要事件，并且過量生成、積聚的炎癥因子與神經細胞死亡也有關。因此，抑制小膠質細胞激活可能是抑制神經炎癥反應的關鍵所在。本研究首次證明了潑尼松龍通過MAPK信號通路抑制LPS激活的BV2細胞中NO/iNOS表達。

NO是一種具有高反應活性的小分子活性物質，在多種生理條件下及病理活動中發揮重要作用。正常情況下NO是一種細胞內信使分子，對機體發揮著有益的調節作用，但當炎癥發生時，會使iNOS表達增高并合成過量的NO，此時NO起細胞毒素分子的作用。LPS是刺激小膠質細胞表達iNOS的最有效刺激物之一，激活的小膠質細胞正是通過iNOS過表達而合成過量的NO，從而造成神經元細胞損傷。有研究報道LPS能高度激活小膠質細胞，并產生 NO、TNF-α、IL-β、自由基及類花生酸類等致炎物質，從而引起神經元損傷〔5，6〕。

MAPK是真核細胞中絲氨酸/蘇氨酸激酶，可激活其他蛋白激酶，可調節轉錄因子活性。MAPK家族包括p38MAPK、ERK和JNK等重要成員。其中多位學者已通過實驗證實p38MAPK參與調控LPS誘導的iNOS表達和NO的產生〔7〕。其中p38MAPK信號通路已被證實是控制炎癥反應的最重要成員之一，p38蛋白磷酸化是確保此通路活化和執行轉導功能的必要條件〔8〕。

潑尼松龍是中效腎上腺皮質激素藥，屬于甾體類抗炎藥。臨床上廣泛應用于各種原因所致的過度的炎癥性疾病，如過敏性疾病、嚴重細菌感染、腫瘤治療、器官移植免疫排斥反應及對糖皮質激素敏感的眼部炎癥等。白宇等〔9〕報道，甲潑尼龍對急性腦衰竭有顯著治療作用。本實驗結果提示，潑尼松龍可能通過抑制p-p38MAPK活化途徑下調iNOS表達和NO產生，從而起抗LPS作用。由于LPS信號轉導通路復雜，涉及信號分子眾多，因而明確潑尼松龍抗LPS機制尚需深入研究。

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8 夏曉東，吳立琴，徐 慧，等.羅紅霉素通過誘導型一氧化氮合酶/一氧化氮途徑抑制哮喘大鼠氣道炎癥〔J〕.中國藥理學通報，2009;25(9)：1223-6.

9 白 宇，侯郁青.甲基潑尼松龍治療急性腦衰竭臨床應用研究〔J〕.臨床急診雜志，2001;2(5)：228-9.