不同電解質(zhì)溶液對(duì)反膠束萃取花生蛋白的影響

孫秀平 陳 軍 陳鋒亮 王憲昌 李明華 趙曉燕

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南 250100)

不同電解質(zhì)溶液對(duì)反膠束萃取花生蛋白的影響

孫秀平 陳 軍 陳鋒亮 王憲昌 李明華 趙曉燕

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南 250100)

研究了 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO48 種不同的電解質(zhì)對(duì) AOT/正己烷反膠束溶液萃取低溫花生粕中花生蛋白的影響，對(duì)反膠束的含水量、蛋白質(zhì)的提取率及通過SDS－PAGE電泳試驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)的亞基條帶進(jìn)行了比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，電解質(zhì)的種類會(huì)影響反膠束的含水量;陰離子與陽(yáng)離子對(duì)反膠束溶液萃取大豆蛋白的前萃與后萃都有影響，電解質(zhì)KCl和NaCl溶液所提取的蛋白質(zhì)得率較高，分別為54.22%和50.19%;不同的電解質(zhì)可以影響所得蛋白的亞基組成，可以用來分離不同的蛋白。

反膠束 電解質(zhì) 花生蛋白 SDS－PAGE電泳

反膠束萃起源于20世紀(jì)70年代，本質(zhì)上是一種液－液萃取，利用表面活性劑在有機(jī)相中形成反膠團(tuán)，從而在有機(jī)相中形成分散的微水環(huán)境，使難溶于有機(jī)相或在有機(jī)相中發(fā)生生物活性變性的生物物質(zhì)溶于其中的萃取技術(shù)，發(fā)展到現(xiàn)在已經(jīng)有30多年的時(shí)間［1－2］，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)其已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究。利用反膠束萃取蛋白質(zhì)是瑞士科學(xué)家Luisi等［3］首次提出的。目前國(guó)內(nèi)也有眾多研究者對(duì)反膠束萃取植物蛋白進(jìn)行了研究。磨禮現(xiàn)［4］以低溫脫溶豆粕為原料對(duì)反膠束萃取過程進(jìn)行了研究;陳復(fù)生等［5］、楊宏順等［6］利用反膠束技術(shù)同時(shí)萃取植物蛋白和植物油。

反膠束體系，是表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中，當(dāng)其濃度超過臨界濃度(CMC)時(shí)，在有機(jī)溶劑中形成的納米級(jí)聚集體［1，7］。反膠束萃取包括前萃(Forward Extraction)和后萃(Backward Extraction)兩個(gè)過程。當(dāng)反膠束溶液與蛋白質(zhì)水溶液或含蛋白質(zhì)的固相接觸后，蛋白質(zhì)可溶于反膠束的“水池”中，稱為前萃;將含有蛋白質(zhì)的反膠束溶液與另一水相接觸，通過改變條件使蛋白質(zhì)從反膠束轉(zhuǎn)移到水相中從而分離出蛋白質(zhì)，稱為后萃［8］。反膠束配制過程中，加入不同的電解質(zhì)會(huì)對(duì)反膠束的水池的大小等有影響，從而蛋白提取率及提取出來的蛋白質(zhì)都會(huì)有所差異。

本試驗(yàn)主要研究了反膠束溶液中加入不同的電解質(zhì)提取花生蛋白，對(duì)蛋白質(zhì)提取率及通過SDSPAGE電泳試驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)的亞基條帶進(jìn)行了比較，以期為反膠束萃取蛋白提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

低溫花生粕:山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)。

AOT(丁二酸二異辛酯磺酸鈉)、正己烷、KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4:天津市富宇精細(xì)化工有限公司;卡爾費(fèi)休試劑:天津賽孚瑞科技有限公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

AFK－1B水分自動(dòng)測(cè)定儀:上海禾工科學(xué)儀器有限公司;K9860凱式定氮儀:美國(guó)海能;PHSJ－3F pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;JY－SCZ2+垂直電泳槽、JY300C電泳儀:北京君益東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料花生粕成分分析

水分測(cè)定:GB 5009.3—2010;粗脂肪含量的測(cè)定:GB 5009.6—2003;粗蛋白的測(cè)定:GB 5009.5—2010;灰分的測(cè)定:GB 5009.4—2010;總糖的測(cè)定:3，5—二硝基水楊酸法;氮溶解指數(shù)(NSI)的測(cè)定:AACC方法46－23。

1.3.2 花生蛋白的提取工藝

AOT反膠束溶液配制:取適量的AOT加入到適量的正己烷中，超聲振蕩使其溶解使其濃度為0.08 g/mL，待溶液透明后中分別加入適量的濃度為0.05 mol/L KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4的 KH2PO4+Na2HPO4緩沖液(調(diào)節(jié) pH 7.0)。圖1是反膠束萃取花生蛋白的工藝流程圖。

圖1 反膠束萃取分離花生蛋白的工藝流程圖

1.3.3 反膠束溶液中含水量的測(cè)定［9］

采用卡爾費(fèi)休法測(cè)定反膠束溶液含水量。首先用卡爾費(fèi)休試劑將甲醇中的水分滴去，然后向甲醇溶液中加入10 μL水，再用卡爾費(fèi)休試劑滴定至終點(diǎn)，測(cè)定卡爾費(fèi)休試劑的響應(yīng)系數(shù)。

響應(yīng)系數(shù)A=進(jìn)樣水分的質(zhì)量/消耗的卡爾費(fèi)休試劑體積

準(zhǔn)確量取50 μL的反膠束溶液，加入到甲醇溶液中，再用卡爾費(fèi)休試劑滴定至終點(diǎn)，則反膠束溶液中所含水分質(zhì)量為:

反膠束所含水分的質(zhì)量=A×消耗的卡爾費(fèi)休試劑體積

反膠束溶液含水量W0=反膠束溶液增溶水分的物質(zhì)的量/反膠束溶液中表面活性劑的物質(zhì)的量

1.3.4 蛋白萃取率的計(jì)算

分別取40 mL配制好的反膠束溶液，根據(jù)1.3.2的試驗(yàn)結(jié)果分別加入 0.05 mol/L 的 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4緩沖溶液，使各種反膠束溶液含水量W0值達(dá)到最大。然后加入一定量的低溫花生粕(精確到0.000 1 g)，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩一段時(shí)間，然后進(jìn)行離心分離去除殘?jiān)＠脛P氏定氮法測(cè)定前萃液中的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白前萃率。

蛋白前萃率=反膠束溶液中蛋白質(zhì)的量/樣品中蛋白質(zhì)的量×100%

向一定體積的前萃液中加入等體積的1 mol/L的 pH 7.0 的 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4緩沖溶液，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩一段時(shí)間后離心，上層為含有油脂的有機(jī)相，下層為含有蛋白質(zhì)的水相。利用凱氏定氮法測(cè)定后萃液中的蛋白含量，計(jì)算蛋白后萃率。

蛋白后萃率=水相中蛋白質(zhì)的總量/前萃液中蛋白質(zhì)的總量×100%

1.3.5 SDS － PAGE 電泳試驗(yàn)［10］

取適量不同電解質(zhì)的后萃液，4℃下透析24～48 h，通過SDS－PAGE電泳試驗(yàn)鑒別花生蛋白亞基結(jié)構(gòu)的變化。配制分離膠為15%，濃縮膠為4.5%;穩(wěn)流法20 mA，染色20 min，脫色48 h以上。反膠束蛋白提取液上樣量分別是15 μL，用考馬斯亮藍(lán)染色，然后用脫色液進(jìn)行脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料主要成分分析

原料主要成分分析結(jié)果如表1所示。

表1 原料主要成分含量

2.2 電解質(zhì)種類對(duì)反膠束含水量的影響

圖2反映了不同電解質(zhì)種類對(duì)AOT反膠束含水量的影響。從圖2中可以看出，對(duì)不同種類的電解質(zhì)緩沖溶液，反膠團(tuán)的含水量均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。通常反膠束中表面活性劑的極性基團(tuán)不是完全電離的，有很大一部分陽(yáng)離子仍在膠團(tuán)的內(nèi)表面上，因此陽(yáng)離子的種類會(huì)影響，該密度越大，產(chǎn)生的反膠束也越大［11］。因此對(duì)于不同的單價(jià)陽(yáng)離子(Li+，Na+和K+)，由于其離子半徑不同(Li+﹤Na+﹤K+)而導(dǎo)致反膠束內(nèi)表面的電荷密度不同，從而導(dǎo)致反膠束的大小不同，表現(xiàn)結(jié)果即為含水量不同。在沒有破環(huán)反膠束體系的前提下，加入相同體積的緩沖溶液，離子半徑越小，反膠束的含水量越大。通過對(duì)分別加入 NaCl、NaNO3、Na2SO4緩沖溶液，KCl、KNO3緩沖溶液和MgCl2、MgSO4緩沖溶液的3組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，陰離子種類對(duì)反膠束含水量的影響較小。

圖2 電解質(zhì)種類對(duì)反膠束含水量的影響

2.3 電解質(zhì)溶液種類對(duì)AOT反膠束提取花生蛋白的影響研究

在AOT反膠束體系分別加入適量的KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4的 KH2PO4+Na2HPO4緩沖液(調(diào)節(jié)pH 7.0)，提取蛋白前萃率與后萃率的結(jié)果如圖3。

圖3 電解質(zhì)種類對(duì)蛋白萃取率的影響

由圖3可以看出，電解質(zhì)的種類不同將會(huì)引起反膠束中蛋白質(zhì)的分布不同。在前萃液中，一價(jià)陽(yáng)離子鹽類萃取率 KCl＞NaCl＞NaNO3＞KNO3＞Na2SO4＞LiCl和二價(jià)陽(yáng)離子鹽類萃取率MgSO4＞MgCl2。相比較而言，總的趨勢(shì)是一價(jià)陽(yáng)離子的鹽類提取率高于二價(jià)陽(yáng)離子鹽類，這與Kinugasa等［12］研究其他的離子的試驗(yàn)結(jié)論不一致。這可能是因?yàn)椋瑢?duì)于不同種類的蛋白質(zhì)電解質(zhì)種類對(duì)其的影響不同［13］。在后萃液中，同樣呈現(xiàn)一價(jià)陽(yáng)離子的鹽類提取率高于二價(jià)陽(yáng)離子鹽類的規(guī)律，這與趙曉燕等［14］在不同電解質(zhì)溶液對(duì)AOT反膠束溶液萃取大豆蛋白的影響研究中得出的結(jié)論一致。另外，陰離子的種類對(duì)蛋白后萃率也有一定的影響，NaCl＞NaNO3＞Na2SO4，可能是因?yàn)閹ж?fù)電荷的蛋白質(zhì)分子與NO3－、Cl－、SO42－發(fā)生了離子交換作用［15］，使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束。KCl和NaCl所提取的蛋白質(zhì)得率較高，分別為54.22%和50.19%，如果將前萃和后萃的工藝進(jìn)一步優(yōu)化，蛋白萃取率有可能進(jìn)一步提高。

2.4 SDS－PAGE電泳試驗(yàn)

圖4是在反膠束體系中加入不同的電解質(zhì)溶液所提取的花生蛋白的SDS－PAGE電泳圖譜。由圖4中可以看出，不同的電解質(zhì)溶液對(duì)所提取的花生蛋白的亞基組成有一定影響，這與Shiomori等［16］發(fā)現(xiàn)的在AOT反膠束中添加不同的鹽離子可提取不同種類的蛋白的結(jié)論一致。加入NaNO3和KNO3的反膠束溶液所提取的蛋白分子質(zhì)量在18.4～45.0 ku附近的亞基較多，蛋白分子質(zhì)量在45.0～66.2 ku附近沒有亞基，而加入KCl和NaCl的反膠束溶液所提取的蛋白分子質(zhì)量在18.4～66.2 ku范圍內(nèi)亞基都有所分布，這說明Cl－與NO3－相比更加有利于大分子蛋白的提取。與花生分離蛋白電泳圖相比較，加入KCl和NaCl所提取的蛋白亞基相似，這說明AOT反膠束中添加KCl和NaCl相對(duì)比較有利于花生蛋白的提取。

圖4 反膠束體系中加入不同電解質(zhì)提取的花生蛋白的電泳譜圖

3 結(jié)論

3.1 卡爾費(fèi)休法測(cè)定反膠束溶液含水量的試驗(yàn)表明，加入不同的電解質(zhì)會(huì)對(duì)反膠束的W0有影響，從而影響蛋白萃取率。

3.2 通過對(duì)反膠束中加入不同電解質(zhì)提取花生蛋白的研究，得出各種不同的陰離子、陽(yáng)離子由于離子半徑、電荷種類、電荷量的不同對(duì)蛋白的萃取過程有一定的影響，從而使得蛋白的前萃率和后萃率均有所不同。通過試驗(yàn)可知，電解質(zhì)KCl和NaCl溶液所提取的蛋白質(zhì)得率較高，分別為54.22%和50.19%。

如果將前萃和后萃的工藝進(jìn)一步優(yōu)化，蛋白萃取率有可能進(jìn)一步提高。

3.3 SDS－PAGE電泳試驗(yàn)表明，反膠束中加入不同的電解質(zhì)可以影響所得蛋白的亞基組成，可以用來分離不同的蛋白。

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Effect of Different Salt Solutions for Extraction of Peanut Protein in Reverse Micelles

Sun Xiuping Chen Jun Chen Fengliang Wang Xianchang Li Minghua Zhao Xiaoyan
(Institute Agro － Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100)

The review studied on effect of different salt solutions(KCl，NaCl，LiCl，MgCl2，NaNO3，KNO3，Na2SO4，MgSO4)for extraction of peanut protein in AOT/N －h(huán)exane reverse micelles from the low －temperature peanut meal，and compared with the W0of the reverse micelles and protein ratio.By SDS － PAGE electrophoresis experiment，compared with subunits of protein.The results showed that different salt solutions could cause the changes of W0.The anions and cations could affect the extraction of soybean protein in AOT reverse micelle.In salt solutions，the KCl and NaCl solutions in reverse micelles would benefit for protein extraction，the assignment of protein was 54.22%and 50.19%，respectively.The different salt solutions could cause the subunits of protein，which can be used to separate different kinds of protein.

reverse micelle，salt solution，peanut protein，SDS － PAGE

TS201.4

A

1003－0174(2012)09－0076－04

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2011GGC02044)，山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2010NY027)

2011－12－01

孫秀平，女，1985年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程

趙曉燕，女，1975年出生，副研究員，碩士生導(dǎo)師，食品理論與加工應(yīng)用及生物粉體技術(shù)