三氧化二砷與還原性谷胱甘肽聯用誘導HL-60細胞株增殖與凋亡的研究

姜華 王曉華

三氧化二砷與還原性谷胱甘肽聯用誘導HL-60細胞株增殖與凋亡的研究

姜華 王曉華

目的 分析研究三氧化二砷與還原型谷胱甘肽聯用對人急性髓性白血病HL-60細胞株增殖與凋亡的影響，并初步探討其誘導HL-60細胞增殖與凋亡的機制。方法 使用CCK8檢測細胞存活率，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果 在實驗條件下，隨著濃度增加，三氧化二砷作用下HL-60細胞增殖有所下降，還原型谷胱甘肽作用下HL-60細胞增殖呈現先升高后降低的趨勢。同步給藥在相同三氧化二砷濃度下，隨著還原型谷胱甘肽濃度增加，細胞存活率有所提高，說明還原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷對細胞的增殖抑制作用。由流式檢測凋亡率結果提示，還原型谷胱甘肽提前給藥增加三氧化二砷對HL-60細胞的促凋亡作用。結論 還原型谷胱甘肽拮抗三氧化二砷對HL-60細胞的增殖抑制作用，而提前給藥可增加其對三氧化二砷的促凋亡作用。

細胞凋亡;細胞增殖;三氧化二砷;還原型谷胱甘肽;白血病

三氧化二砷用于治療急性早幼粒白血病最先在我國獲得成功，尤其對于難治、復發的APL效果突出，其主要機理是誘導腫瘤細胞的凋亡，而氧化應激一直被認為是三氧化二砷誘導細胞凋亡的關鍵原因。還原性谷胱甘肽是廣泛存在于細胞內的小分子三肽化合物，由谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸組成，參與細胞內氨基酸轉運、糖代謝和DNA合成調節。它既是細胞自由基的清除劑又可作為一種氧化物前體，參與著機體氧化應激過程。本實驗旨在探討三氧化二砷與還原性谷胱甘肽聯合用藥對HL-60細胞株增殖與凋亡的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人白血病細胞(HL-60)由中國醫科大學腫瘤研究所提供，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒由碧云天提供，CCK-8試劑盒由日本同仁化學研究所提供，瑞氏-姬姆薩染色試劑盒由南京建成科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代培養 HL-60細胞培養于含有10%胎牛血清的改良1640培養基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養，每2～3天傳代1次，實驗均選用對數生長期細胞。

1.2.2 CCK-8檢測 ①單因素實驗組分別繼續培養12、24、48、72 h;正交實驗組以及不同給藥方式對HL-60細胞存活率影響實驗組培養時間依據相應的實驗樣本編號表(表1)。②培養時間點到達后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培養箱中孵育1 h，450 nm下測定吸光度值，進行數據分析。1.2.3 瑞氏-姬姆薩染色 實驗組細胞涂片經瑞氏工作液染色1分鐘，再加吉姆薩工作液染色20分鐘后自然風干，光鏡下觀察凋亡小體。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 ①800 rpm離心10 min收集細胞，小心吸除上清，加入1 ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞，800 rpm離心10 min收集細胞，小心吸除上清，殘留約50 μl左右的PBS，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。②加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。③800 rpm離心10 min收集細胞，小心吸除上清，殘留約 50 μl左右的液體，加入190 μl Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞。④加入10 μl Annexin碘化丙啶染色液，輕輕混勻。冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

表1 實驗樣本編號分組

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 由直觀分析表中極差值可以得出，隨著濃度增加，三氧化二砷作用下HL-60細胞增殖有所下降，還原型谷胱甘肽作用下HL-60細胞增殖呈現先升高后降低的趨勢。

2.2 由三氧化二砷和還原型谷胱甘肽的交互作用表可以得出，同步給藥，在同一三氧化二砷濃度下，隨著還原型谷胱甘肽濃度增加，細胞存活率有所提高，說明還原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷對細胞的增殖抑制作用。

2.3 光鏡下觀察，HL-60細胞經加藥處理后出現部分細胞被染深藍色現象，說明出現細胞凋亡情況;且單獨加As2O3組，細胞凋亡明顯。

2.4 不同藥物作用后HL-60細胞流式檢測細胞凋亡的變化，見圖1。

圖1 流式細胞圖

3 討論

目前治療白血病的主要手段仍是化療，但化療藥物在摧毀白血病細胞克隆的同時，也抑制正常骨髓的造血功能，骨髓抑制期發生的貧血、出血、感染、臟器損害等合并癥，是化療后患者死亡的主要原因。化療藥物常常在殺傷腫瘤細胞的同時，不同程度的損傷機體的正常組織和器官，影響化療進程及藥物劑量的選擇。在提高白血病的治療效果并減輕其毒副反應是當前白血病治療的迫在解決的問題之一。

還原性谷胱甘肽(glutathi-one，GSH)是廣泛存在于細胞內的小分子三肽化合物，在拮抗氧化性毒物中發揮重要作用，一方面可與毒物分子及其代謝物發生結合反應降低毒物毒性;另一方面可通過氧化還原反應而降低毒物過氧化的能力，使含巰基酶免于被重金屬和氧化劑激活或使已氧化的含巰基酶還原而使其恢復活性。在自由基大量產生時，細胞膜不飽合脂肪酸氧化成脂過氧基，并引起一系列繼發損傷。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止連鎖反應，其本身則被氧化成谷胱甘肽氧化型(oxidized glutathione，GSSG)。同樣，GSH在對抗氧自由基過氧化并抑制由此引發的細胞凋亡、壞死及自穩態改變等方面亦發揮著重要作用［1］。

Chen等［2］認為三價砷是巰基的絡合劑，與巰基有很強的親和力，且它與鄰近含巰基或二巰基功能基團的蛋白質的結合能力遠高于含單巰基者，因此推測含二巰基基團的蛋白質可能是三氧化二砷作用的主要靶分子。研究證實，砷化物與-SH結合后可能通過多條途徑誘導細胞凋亡，比如激活核因子κB使其表達增加，下調凋亡調控基因Bcl-2，上調抑癌基因p53等。此外，砷與-SH結合還直接導致細胞內的GSH耗竭，使活性氧產生增多，而活性氧已被證實是重要的細胞凋亡介質。以上進一步說明，三氧化二砷的凋亡效應與細胞谷胱甘肽氧化還原系統密切相關，三氧化二砷的這一作用與其本身的性質有關。

本組結果顯示，表明還原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷對細胞的增殖抑制作用。但調整給藥時間及順序，提前應用還原型谷胱甘肽將增加三氧化二砷對HL-60細胞的促凋亡作用。因此，為臨床上合理用藥，降低化療副作用保護正常組織的同時而更好的殺傷腫瘤細胞提供理論支持。

［1］趙克然，楊毅軍，曹道俊.氧自由基與臨床.北京：中國醫學科技出版社，2000：47-56.

［2］張曉紅，蘇立達，呂慶華.三氧化二砷誘導K562細胞凋亡過程中IJB-A、NF-JB蛋白表達的研究.實用腫瘤雜志，2004，19(4)：292-295.

136000 中國醫科大學四平醫院血液科

王曉華