采用響應面法優化舊報紙的裂褶菌粗酶液脫墨

黃彩霞 趙德清 陳繼偉

(1．廣東省造紙研究所，廣東廣州，510300;2．華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640)

采用響應面法優化舊報紙的裂褶菌粗酶液脫墨

黃彩霞1趙德清2陳繼偉1

(1．廣東省造紙研究所，廣東廣州，510300;2．華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640)

利用裂褶菌 (Schizophyllum Commune)在限氮培養條件下產生的粗酶液對舊報紙進行脫墨，采用響應面法中的Box-Behnken實驗設計，對影響脫墨的主要因素酶用量、溫度和pH值進行優化，得到了用于預測脫墨漿有效殘余油墨濃度 (ERIC值)和白度值的數學模型。模型方差分析和響應面曲線分析表明，pH值對裂褶菌粗酶液脫墨效果的影響最為顯著。優化結果顯示，當酶用量0．20 IU/g、溫度52．5℃和pH值6．5時，脫墨漿有效殘余油墨濃度最低，為208．0 mg/kg;當酶用量0．24 IU/g、溫度52．2℃和pH值6．5時，脫墨漿白度最高，為53．3%。驗證實驗證明了模型優化的準確性。

響應面法;裂褶菌;粗酶液;脫墨

酶法脫墨技術是利用酶的生物化學作用進行脫墨，能較好地解決環境污染和廢紙質量下降等問題，通常使用最多的是纖維素酶和半纖維素酶［1-3］，且脫墨工藝多采用添加一種酶進行。將多種酶混合共同作用于廢紙脫墨是目前的研究熱點。

裂褶菌 (Schizophyllum commune Fr．)又稱白參、樹花，隸屬于真菌門 (Eumycophyta)，擔子菌綱(Basidiomycetes)，傘菌目 (Agaricales)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)， 裂 褶 菌 屬 (Schizophyllum)［4］，它是一種珍貴的食藥兩用真菌。裂褶菌發酵培養時不僅可產生具有抗腫瘤活性的裂褶胞外多糖，同時還產生一些重要的酶。有研究表明，裂褶菌在特定的培養條件下可產生纖維素酶、纖維二糖脫氫酶［5-7］、聚木糖酶［8-10］、酯酶［11］、錳過氧化物酶［12］等，這些酶共存于裂褶菌發酵培養所得到的粗酶液中，其中纖維素酶和聚木糖酶均可用于舊報紙的脫墨，但利用裂褶菌粗酶液對舊報紙進行脫墨的研究尚未見報道。

響應面法是一種利用數理統計知識，通過數學建模和分析，評估多個自變量單獨和同時對因變量影響的方法，其主要目標是利用模型優化因變量的響應［13］。響應面曲線法的優點在于能從最少的實驗次數中獲得最多的信息，其數學模型如式 (1)所示。

式中，Xi和Xj表示自變量，Y表示響應變量，β0、βi、βii和 βij為方程的系數，Xi、X2i和XiXj分別代表因素的線性影響、平方影響和因素間的協同影響。

本實驗利用裂褶菌在限氮培養條件下產生的含有纖維素酶和聚木糖酶的粗酶液對舊報紙進行脫墨，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法中的Box-Behnken實驗設計，對影響脫墨的主要因素酶用量、溫度和pH值進行優化，進一步考察裂褶菌對舊報紙的脫墨效果，旨在為廢紙漿生物酶脫墨提供一種新的思路。

1 實驗

1.1 原料

菌種:裂褶菌 (Schizophyllum commune GIM5．44)，購于廣東省微生物菌種保藏中心。廢紙:8#美廢與國產舊報紙按質量比2∶1混合。

1.2 培養基

斜面培養基:20%馬鈴薯汁1 L、葡萄糖20 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1．5 g/L、VB10．01 g/L、瓊脂20 g/L、pH值6。

限氮培養基:0．1 g/L VB110 mL，1．5 mmol藜蘆醇，BI微量元素溶液70 mL，0．1 mol/L丁二酸二甲酯(pH值4．2)100 mL或0．1 mol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液(pH值4．2)100 mL，葡萄糖10 g/L，酒石酸銨0．2 g/L，KH2PO42．0 g/L，CaCl20．1 g/L，MgSO4·7H2O 0．5 g/L。

BI微量元素溶液:MgSO4·7H2O 3 g/L，MnSO4·H2O 0．5 g/L，NaCl 1．0 g/L，FeSO4·7H2O 0．1 g/L，CoCl2·6H2O 0．185 g/L，CaCl20．08 g/L，ZnSO4·7H2O 0．18 g/L，CuSO4·5H2O 0．1 g/L，AlK(SO4)2·12H2O 0．01 g/L，H3BO30．01 g/L，Na2MoO4·2H2O 0．012 g/L，氨基乙酸 1．5 g/L。

1.3 儀器

SPX-150BS-Ⅱ生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司;UV-1800分光光度計，日本;CL-32L高溫滅菌鍋，日本ALP;HQ45B氣浴恒溫搖床，中科院武漢科儀廠;HH-S電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器廠;ZT13-00浮選脫墨槽，中通試驗裝備技術研究所;PK-3A-KWT PTI紙頁成形器;Technidyne Color Touch ERIC950殘余油墨測定儀，美國。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種培養方法

將裂褶菌接種于斜面培養基上，在培養箱中28℃下培養3～4天，用無菌水洗入三角燒瓶中，用勻漿器打勻成碎菌絲片段，吸取40 mL移至裝有400 mL限氮培養基的 1000 mL錐形瓶中，置于 28℃、130 r/min恒溫搖床上振蕩培養7天，形成大小一致的菌絲球懸浮液。菌絲球懸浮液于高速冷凍離心機上離心10 min(5000 r/min，4℃)，取上清液，即為粗酶液。

1.4.2 酶活測定

纖維素酶和聚木糖酶的酶活測定分別按GB/T 23881—2009和GB/T 23874—2009進行。粗酶液中聚木糖酶酶活166．75 IU/mL，纖維素酶酶活22．15 IU/mL。

1.4.3 粗酶液處理廢紙漿及浮選脫墨

稱取180 g廢紙漿，與粗酶液在聚乙烯密封袋中充分混合后置于恒溫水浴鍋中加熱，每15 min揉搓一次，使漿料與酶液混合均勻，充分反應，反應一定時間后取出進行浮選脫墨。對照樣是以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液替代粗酶液，其他條件同粗酶液浮選脫墨。

浮選條件:漿濃0．8%，時間10 min，室溫。浮選后將脫墨漿進行洗滌、抄片。

1.4.4 分析檢測

有效殘余油墨濃度 (ERIC值)采用近紅外反射測定法，在Technidyne Color Touch ERIC950殘余油墨測定儀上進行測定，并同時測得脫墨漿白度。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

首先進行了裂褶菌粗酶液脫墨的單因素實驗，實驗結果表明［14］，裂褶菌產粗酶液用于舊報紙脫墨的較佳工藝條件為:pH值6．5，溫度60℃，酶用量0．3 IU/g，反應時間1．5 h，其中pH值、溫度和酶用量是影響脫墨效果的主要因素。在此優化工藝條件下，與對照樣相比，粗酶液脫墨漿的ERIC值下降了95．7 mg/kg，白度提高了3．5個百分點。

為了進一步考察工藝因素對脫墨效果的影響以及因素間的協同效應，采用響應面實驗設計方法對酶用量、反應溫度和pH值進行優化，利用Design Expert Version 8．0．5b(Stat-Ease，Inc)軟件，采用 Box-Behnken實驗設計方案，以酶用量 (X1)、反應溫度(X2)和pH值 (X3)為自變量，以酶液處理后脫墨漿的ERIC值 (Y1)和白度值 (Y2)為響應變量，進行三因素三水平的響應面實驗設計。根據單因素實驗結果，確定響應面實驗設計中酶用量的中心點為0．6 IU/g，步長為0．4 IU/g;反應溫度的中心點為50℃，步長為10℃;pH值的中心點為5．5，步長為1。實驗設計的變量與取值如表1所示。

表1 裂褶菌產粗酶液脫墨過程影響因素的取值范圍

2.2 Box-Behnken實驗

根據Box-Behnken實驗設計方案，考察3個自變量時需要進行17組實驗，為了減少系統誤差，從實驗設計的標準次序中隨機抽取，進行了實驗序號重排，實驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

從表2可知，通過改變酶用量、溫度和pH值，脫墨漿的ERIC值在200～260 mg/kg之間變化，白度在50%～54%之間變化。不同的因素組合下，脫墨效果差異較大。最佳的脫墨條件為4#實驗 (以實驗序號計，下同):酶用量0．2 IU/g，溫度50℃，pH值6．5，在此條件下脫墨漿的ERIC值為209．7 mg/kg，白度為53．2%。當pH值為4．5時 (11#實驗，酶用量0．2 IU/g、溫度50℃、pH 值4．5)，與 4#實驗相比，脫墨漿ERIC值上升41．5 mg/kg，白度下降2．4個百分點，可見隨著pH值由6．5降為4．5，裂褶菌粗酶液的脫墨效果明顯下降。從表2還可以看出，2#與5#實驗、3#與17#實驗、9#與16#實驗脫墨效果的對比均顯示了同樣的規律，即在粗酶液用量和反應溫度不變的條件下，提高反應體系的pH值可以改善粗酶液的脫墨效果。由此可見，與酶用量和反應溫度兩個因素相比較，pH值是脫墨效果的顯著影響因素。

2.3 模型建立及顯著性分析

利用Design Expert軟件，按照式 (1)對表2中數據進行擬合，得到了表示脫墨后ERIC值 (Y1)和白度 (Y2)的回歸方程，分別為:

式 (2)和式 (3)即為以酶用量 (0．2～1．0 IU/g)、溫度 (40～60℃)和 pH 值 (4．5～6．5)為自變量時，ERIC值和白度的預測模型。圖1和圖2分別為ERIC值和白度的模型預測值與實驗值的對應關系。從圖1～圖2可見，ERIC值預測值與實驗值吻合較好。

圖1 ERIC值模型預測值與實驗值的關系

圖2 白度模型預測值與實驗值的關系

為了說明以上兩個模型的有效性，分別對其進行方差分析，ERIC值預測模型的方差分析如表3所示。

表3 ERIC值預測模型的方差分析

從表3可以看出，ERIC值預測模型［式 (2)］的F檢驗值為82．20，p值＜0．0001，說明該模型是顯著的。同時，對模型的缺適性進行檢驗，p值=0．2481，p值＞0．1，缺適性不顯著，說明模型滿足預期假設。因此，該模型在統計上是可行的。通過回歸分析可知，模型的系數R2值高達0．9906，表明該模型與實際情況擬合得很好，99．06%的實驗數據的可變性可用此模型解釋。模型中各項的方差分析表明，X3、X22、X23是模型中的顯著項 (p值＜0．05)，其中pH值對因變量ERIC值影響顯著 (p值＜0．0001)。

表4為白度預測模型 ［式 (3)］的方差分析，同樣，其模型的F檢驗值為22．63，p值=0．0002，p值 ＜0．0001，模型缺適性的 p值 =0．4543，p值 ＞0．1也說明了該模型在統計上的有效性。在對因變量白度的影響上，X3、X22、X23都起顯著作用 (其p值均＜0．05)，其中 pH值對白度值影響顯著 (p值 ＜0．0001)。模型的R2=0．9668，說明模型具有較好的預測性。

表4 白度預測模型的方差分析

2.4 響應面曲線分析

圖3和圖4分別是根據白度和ERIC值的數學模型固定其中一個自變量而作出的三維響應面曲線圖，直觀地表示出了酶用量、反應溫度和pH值3個因素對粗酶液脫墨效果的影響。

從圖3(a)可以看出，溫度對粗酶液脫墨漿白度的影響大于酶用量的影響。脫墨漿白度隨酶用量的增加，變化幅度不明顯，但溫度從40℃上升到60℃時，表現出先升高后降低的趨勢。這可能是因為在一定的溫度范圍內，提高溫度可以加快催化反應速度，但較高溫度又會引起酶的變性，導致酶活性降低，反應速度下降。因此存在一個最優溫度值使粗酶液中兩種酶的綜合活性最高，協同作用最強，脫墨漿白度最高。圖3(b)為酶用量和pH值對脫墨漿白度的影響，隨pH值的升高，脫墨漿白度急劇升高，而酶用量的增加并沒有引起白度太大幅度的變化。圖3(c)為溫度和pH值對脫墨漿白度的影響，可以看出pH值對脫墨效果的影響是最為顯著的，提高pH值對脫墨漿白度的改善較為顯著。

從圖4可以看出，pH值對脫墨漿ERIC值的影響最大，是顯著影響因素，表現為曲線較陡;酶用量和溫度的影響較小，表現為曲線相對較平。因此選擇合適的pH值，對獲得較佳的脫墨效果尤為重要。

2.5 脫墨過程影響因素的優化及模型驗證

利用Design Expert軟件中的優化工具，對模型式(2)和式 (3)中的各因素進行優化，得到溫度、酶用量和pH值的最佳組合，以使舊報紙脫墨漿的ERIC值和白度達到最佳，優化結果如表5所示。

表5 脫墨影響因素的優化取值

從表5可以看出，當酶用量0．20 IU/g、溫度52．5℃、pH 值 6．5時，脫墨漿 ERIC 值最低為208．0 mg/kg;當酶用量 0．24 IU/g、溫度 52．2℃、pH值6．5時，脫墨漿白度最高為53．3%。利用上述優化條件進行驗證實驗，實驗值和模型預測值的對比如表6所示。由表6可見，優化條件下實驗所得的脫墨漿ERIC值和白度與模型的預測值非常接近，表明模型 (2)和模型 (3)可以準確地預測裂褶菌粗酶液舊報紙脫墨工藝，模型預測具有較高的準確性。

表6 優化條件下實驗值與模型預測值的對比

3 結論

利用響應面法中的Box-Benhnken實驗設計對舊報紙裂褶菌粗酶液脫墨過程的3個影響因素 (酶用量、溫度和pH值)進行優化，通過數據擬合和回歸分析，得到了用于預測脫墨漿有效殘余油墨濃度(ERIC)值和白度的預測模型，方差分析證明模型在統計上是顯著有效的。模型的方差分析和響應面曲線分析表明，pH值對脫墨效果的影響最為顯著。

利用Design Expert軟件對ERIC值和白度預測模型中的因素進行優化，得到使響應變量達到最佳的工藝條件分別為:當酶用量0．20 IU/g、溫度52．5℃、pH 值 6．5時，脫墨漿 ERIC 值最低為208．0 mg/kg;當酶用量 0．24 IU/g、溫度 52．2℃、pH值6．5時，脫墨漿白度最高為53．3%。驗證實驗證明了模型優化的準確性。

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Optimization of Schizophyllum Commune Deinking of Waste Newspaper by Response Surface Methodology

HUANG Cai-xia1，*ZHAO De-qing2CHEN Ji-wei1
(1．Guangdong Paper Industrial Research Institute，Guangzhou，Guangdong Province，510300;2．State Key Lab of Pulp and Paper Engineering，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong Province，510640)
(*E-mail:ruochenbb@hotmail．com)

The deinking of waste newspaper with the crude enzymes produced by Schizophyllum commune in nutrient nitrogen limited culture medium was studied．Box-Behnken design in Response Surface Methodology was employed to optimize the main factors including enzymes dosage，temperature and pH which influence the deinking result，and two mathematic models were proposed to predict the effective residual ink concentration(ERIC)and brightness of the pulp．The experiment results showed that pH had more obvious influence on Schizophyllum Commune deinking．The lowest ERIC of the pulp 208．0 mg/kg was reached while the deinking parameters were as follows:enzymes dosage 0．20 IU/g，temperature 52．5℃ and pH 6．5．When enzymes dosage，temperature and pH were 0．24 IU/g，52．2℃ and 6．5 respectively，the brightness of the pulp peaked at 53．3%ISO．Comparing the experimental data and predicted date，the models were confirmed to be of high precision．

response surface methodology;Schizophyllum Commune;crude enzymes;deinking

TS724

A

0254-508X(2012)05-0019-06

黃彩霞女士，助理工程師;主要研究方向:制漿化學及造紙化學品。

2012-01-13(修改稿)

本課題得到廣東省科技計劃項目 (2009B011200009)資助。

(責任編輯:郭彩云)