幽門螺桿菌對腸化生胃黏膜GST-π和p53表達的影響

王旭光 張 忠 吳麗華 郭 麗 吳 璠 阿 良 李 想(沈陽醫學院病理教研室，遼寧 沈陽 0034)

幽門螺桿菌對腸化生胃黏膜GST-π和p53表達的影響

王旭光 張 忠 吳麗華 郭 麗 吳 璠 阿 良1李 想(沈陽醫學院病理教研室，遼寧 沈陽 110034)

目的 探討幽門螺桿菌(HP)對腸化生胃黏膜GST-π和p53表達的影響。方法 采用免疫組化染色檢測30例正常胃黏膜、182例腸化生胃黏膜和32例胃癌組織GST-π和p53蛋白表達狀況;采用HE染色和ELISA方法判斷HP感染。結果 HP陽性腸化生組GST-π表達陽性率顯著高于正常胃黏膜和胃癌組(P＜0.01)，顯著低于HP陰性腸化生組(P＜0.01)。HP陽性腸化生組p53蛋白表達陽性率顯著高于正常胃黏膜和HP陰性者，顯著低于胃癌組(P＜0.01)。HP陽性腸化生經HP根除治療后，其GST-π表達陽性率高于根除治療前(P＜0.05)，p53蛋白表達陽性率低于根除治療前(P＜0.01)。結論 HP感染可能通過降低GST-π表達、削弱GST-π的保護性作用和增強突變型p53基因的表達增強而在胃癌的發生發展過程中發揮作用。早期進行HP根除治療，對于降低胃癌發生具有現實意義。

幽門螺桿菌;腸化生;π類谷胱甘肽轉移酶;p53

近年來，大量的流行病學資料顯示，幽門螺桿菌(HP)感染與胃黏膜腸上皮化生(IM)和胃癌有密切的關系，但HP感染如何導致IM乃至胃癌發生仍不清楚。π類谷胱甘肽轉移酶(GST-π)是人體內重要的保護性物質，具有解毒和抗癌作用〔1〕。野生型p53基因是目前研究最廣泛的抑癌基因，突變型p53表現為癌基因的作用，是人類腫瘤晚期的重要分子事件〔2〕。相關IM的發生發展中GST-π和p53發揮著什么樣的作用，尚不清楚。本研究擬探討HP相關性IM的發生發展機制。

1 材料與方法

1.1 對象及分組

所有胃黏膜組織和血清樣品均來自2000～2005年中國醫科大學第一臨床醫院、遼寧省腫瘤醫院和沈陽醫學院附屬奉天醫院。經病理學診斷證實，研究對象包括正常對照組30例，IM組182例和胃癌組32例。上述各組性別及年齡構成上均無顯著差異，胃癌患者均為初治。

1.2 方法

1.2.1 血清的采集 采血前1 d晚禁食、水、吸煙。抽取受檢者5 ml空腹外周靜脈血，室溫靜置 1 h，2 400 r/min離心10 min，吸取血清分裝后，-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 胃黏膜活檢組織的收集 用胃鏡分別于胃竇、胃角和胃體部取活檢組織，經95%酒精或10%中性甲醛固定。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色 梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片，厚5 μm。常規HE染色，進行病理診斷和HP觀察。HE染色后于光學顯微鏡下觀察HP的感染情況，胃黏膜表面黏液層及小凹上皮內見少量單曲或S型彎曲狀的桿狀細菌者為HP陽性(+)，中等量者為?，大量者為?。

1.2.4 ELISA檢測血清HP IgG抗體 按試劑盒操作(試劑盒購于Biohit plc，芬蘭)，450 nm波長下測量吸光度，百德軟件處理，得出血清HP IgG抗體濃度值。

1.2.5 HP感染判定 以HP組織學觀察和血清HP IgG抗體檢測結果綜合判定HP感染狀況。符合以下三種情況之一者判定為陽性：(1)血清HP IgG抗體≥44單位者判為陽性;(2)組織學檢測HP?及以上者判為陽性;(3)血清HP IgG抗體介于32～44單位之間，且組織學檢測HP+者，判為陽性。據此，腸化生組分為HP陽性組86例和HP陰性組96例。組間性別及年齡構成無顯著差異。

1.2.6 HP根除治療 對HP陽性者給予有機鉍劑(胃敏膠囊)、甲硝唑、羥氨芐青霉素三聯藥物治療，3個月治療結束，停藥4 w后，復查胃鏡HP仍保持陰性者判為HP根除。經上述方法判定，HP根除者45例，HP未根除者41例。

1.2.7 免疫組織化學(SP)法檢測GST-π和p53蛋白表達按試劑盒說明操作。磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照，已知陽性片作陽性對照。GST-π和p53蛋白即用型一抗均購于福州邁新。

1.2.8 結果判定 GST-π以細胞質內和(或)細胞核出現棕黃色顆粒判定為陽性。陰性：無棕色反應;陽性：淡黃色(只染色個別腺體或個別細胞)或棕黃色(彌漫在整個細胞質內，其分布范圍較廣泛呈多灶性)或棕色(出現于細胞質和細胞表面及腺腔內，分布廣泛)。p53蛋白以細胞核呈棕黃色著色判定為陽性。陰性：整張切片無一個陽性細胞;陽性：陽性細胞數＞1%以上。

1.3 統計學方法

應用SPSS17.0軟件行χ2檢驗。

2 結果

2.1 HP感染對IM胃黏膜GST-π和P53蛋白表達的影響

正常胃黏膜組織中未見GST-π表達;IM胃黏膜GST-π呈散在表達，陽性產物主要分布在細胞質內，少數分布在刷狀緣和細胞核;胃癌組織中GST-π呈片狀彌漫強陽性著色。86例HP陽性IM胃黏膜組GST-π表達陽性率為55.8%(48例)，顯著高于正常胃黏膜組(0%)，顯著低于 HP陰性 IM組〔76例(79.2%)〕(P＜0.01)，與胃癌組〔14例(43.8%)〕相比，無統計學差異;HP陰性IM胃黏膜組GST-π表達陽性率顯著高于正常胃黏膜組和胃癌組(P＜0.01)，胃癌組的GST-π表達陽性率顯著高于正常胃黏膜組(P＜0.01)。正常胃黏膜組織中未見p53蛋白表達;IM胃黏膜、胃癌組織中p53蛋白均呈陽性表達，陽性產物主要局限于胃黏膜上皮細胞和腫瘤細胞核內。HP陽性IM組p53蛋白表達陽性率〔38例(44.2%)〕顯著高于正常胃黏膜組(0%)和HP陰性IM組〔9例(9.4%)〕，顯著低于胃癌組〔24例(75.0%)〕(P＜0.01);HP陰性IM組p53蛋白表達陽性率與正常胃黏膜組相比無統計學差異，胃癌組的p53蛋白表達陽性率顯著高于正常胃黏膜組和HP陰性IM組(P＜0.01)。見圖1。

2.2 HP根除治療前后IM胃黏膜GST-π和P53蛋白表達的變化

根除治療后HP仍為陽性者41例，HP轉陰45例。HP轉陰的45例IM胃黏膜中36例(80.0%)GST-π呈陽性表達，顯著高于根除治療前(55.6%)(P ＜0.05)，與HP陰性IM組比較無統計學差異。HP轉陰的45例中8例(17.8%)p53蛋白表達陽性，顯著低于根除治療前(44.4%)(P＜0.01)，與HP陰性IM組比較無統計學差異。根除治療后，HP未根除組GST-π和p53蛋白表達陽性率分別為58.6%和39.0%，與根除治療前比較無統計學差異。

圖1 IM胃黏膜組織GST-π、p53陽性表達(SP)

3 討論

野生型p53基因具有引起細胞周期阻滯，誘導凋亡和促進分化的腫瘤抑制基因的作用。而突變型p53基因則表現出促進細胞惡性轉化，抑制細胞凋亡，加速細胞增殖的癌基因的作用。研究顯示，野生型p53蛋白的半衰期較短，一般僅為2 min;突變型p53蛋白因構型的變化更加穩定，半衰期可明顯延長至1.47 h，故可通過免疫組化技術加以檢測，提示突變型p53基因的存在〔3〕。

GSTs是人體內重要的Ⅱ相解毒酶，主要功能是參與經由食物和藥物等進入人體的有毒物質的代謝，催化谷胱甘肽與親核物質(有毒物質、烷化劑、蒽環類抗腫瘤藥物)結合，并以硫醚氨酸結合物這種無毒物質的形式從尿中排出，或代謝為無毒性的醇類物質。因此，GSTs是人體內重要的保護性物質。依同工酶等電點的不同，GSTs分為堿性α類、中性μ類和酸性π類，其中 GST-π 與腫瘤密切相關〔4～6〕。

作為內在的重要保護性因素，無論是p53基因還是GST-π，勢必都會在機體遭受外在因素損害后發揮相應的生物學作用，進而引起某些量或質的變化。本研究結果提示，在胃癌形成前，從正常胃黏膜到發生IM，GST-π作為保護性物質已被激活;隨著機體損傷和病變的加重，GST-π的保護作用開始減弱甚至喪失，胃癌即可能發生。目前關于GST-π的激活機制尚不清楚，研究認為，可能是GST-π活性部位的關鍵殘基第47位的半胱氨酸和第162位的組氨酸被激活〔7〕。進一步的分析顯示，HP感染可使GST-π表達降低，并可通過降低機體的保護作用而使胃癌發生的危險相對增加。由于HP的菌體蛋白可激發單核細胞和巨噬細胞釋放自由基，后者具有強大的破壞作用，可使核酸主鏈斷裂，堿基降解和氫鍵破壞，形成直接致癌或促癌作用〔8，9〕。GST-π具有類似谷胱甘肽過氧化酶的抗氧化作用，能通過酶蛋白自身的氧化(SH基氧化成-S-S-)清除活性氧或自由基〔5〕。因此，當GST-π的保護作用無法抵抗HP的致毒作用時，即表現出表達降低。

本研究結果提示，HP感染可促進突變型p53基因的表達增強，并可始于Correa的“正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌”這一胃癌發生模式中的較早階段IM。HP感染后可導致胃黏膜一氧化氮合成酶增多、氧自由基釋放〔10〕，進而引起 DNA 損傷，p53 基因突變〔11〕。隨著p53基因突變量和表達量的積累以及其他致癌因素的共同作用，細胞可以無限生長，細胞凋亡減少或不凋亡〔12〕，最終導致胃癌發生。

綜上，筆者推測HP感染可能通過促使GST-π表達降低、削弱GST-π的保護性作用和促進突變型p53基因的表達增強而在胃癌的發生發展過程中發揮作用。預防HP感染，早期進行HP根除治療，對于降低胃癌發生具有現實意義。

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R57

A

1005-9202(2012)23-5142-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.019

1 沈陽醫學院附屬中心醫院

王旭光(1971-)，女，博士，副教授，主要從事胃癌癌前病變研究。

〔2012-08-06收稿 2012-10-08修回〕

(編輯 袁左鳴)