降鈣素基因相關肽對腦死亡大鼠肺組織氧化應激的影響

苗麗君 張瑞霞 王 靜 蔣軍廣 韓雪萍 張水軍 孫振濤

(鄭州大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州450052)

降鈣素基因相關肽對腦死亡大鼠肺組織氧化應激的影響

苗麗君 張瑞霞 王 靜 蔣軍廣 韓雪萍1張水軍2孫振濤1

(鄭州大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州450052)

目的 觀察腦死亡大鼠肺組織的氧化應激反應以及降鈣素基因相關肽(CGRP)干預處理對腦死亡大鼠肺組織氧化應激的影響。方法 健康Wistar大鼠15只，隨機分為3組，即對照組(A組)、腦死亡組(B組)及CGRP處理組(C組)，每組5只。A組持續麻醉維持12 h。B組通過呼吸、循環支持維持大鼠腦死亡狀態12 h。C組于腦死亡模型建立成功后靜脈輸注CGRP 3 μg/kg，隨后給予CGRP 6 μg/kg持續輸注維持12 h，維持實驗動物腦死亡狀態12 h。于腦死亡后12 h取肺臟組織，檢測MDA含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性及肺組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA和蛋白表達水平。結果 肺組織中MDA含量B組高于A組及C組(P＜0.05)，肺組織SOD活性C組高于B組及A組(P＜0.05)，肺組織γ-GCS mRNA水平C組＞B組＞A組，γ-GCS蛋白水平C組＞A組＞B組，組間比較差異均有統計學意義(均P＜0.05)。結論 腦死亡可導致大鼠肺組織氧化應激反應增強，抗氧化能力減弱;CGRP可增高腦死亡大鼠肺組織γ-GCS蛋白水平，增高抗氧化能力，抑制氧化應激反應。

腦死亡;肺;氧化應激;降鈣素基因相關肽

腦死亡供體的器官保護已經成為器官移植技術的關鍵環節之一，有效的器官保護不僅可以提高移植后器官的成活率，也能加快器官功能的恢復，腦死亡供體器官損傷的機制及防護已經成為目前的研究熱點。研究證實氧化應激在肺損傷的發生發展中具有重要作用〔1～3〕。降鈣素基因相關肽(CGRP)有血管舒張作用，心肌正性變力、變時作用，缺血再灌注損傷保護作用等多種生物學功能〔4〕。本實驗擬在建立大鼠腦死亡模型基礎上，檢測肺組織中氧化應激(OS)水平的改變，以及CGRP干預處理對腦死亡大鼠肺組織OS的影響，為腦死亡后的肺保護提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

健康Wistar大鼠15只，雌雄不限，體重250～300 g，SPF級，由河南省實驗動物中心提供。術前12 h禁食，自由飲水。肌內注射阿托品0.03 mg/kg，10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉。麻醉后，行股動靜脈插管、氣管內插管，開顱后顱內放置Foley氣囊導管。隨機分為3組：對照組(A組)、腦死亡組(B組)與CGRP組(C組)，每組5只。A組持續麻醉維持12 h，不建立腦死亡模型，12 h后撤除麻醉，動物蘇醒后處死。B組大鼠參照文獻〔5～7〕，在球囊導管內逐漸緩慢注入生理鹽水行顱內加壓，加壓速度約為0.1 ml/min，直至達到腦死亡狀態;大鼠呼吸停止后，將氣管導管接Harvard Inspira ASV動物呼吸機，機控呼吸，設定呼吸機參數為：潮氣量為8.0 ml/kg，呼吸頻率為60次/min;維持平均動脈壓在正常范圍(60 mmHg以上)，必要時根據情況使用多巴胺及血管加壓素等血管活性藥物;腦死亡判定標準為：瞳孔散大固定，無角膜反射、對刺激無反應、腦干反射消失、呼吸停止、靜息腦電圖〔8〕;通過呼吸、循環支持維持實驗動物腦死亡狀態12 h;12 h后撤除呼吸、循環支持，動物心肺死亡。C組為CGRP干預的腦死亡組，同樣采用緩慢顱內加壓法建立大鼠腦死亡模型;于腦死亡模型建立成功后經靜脈用微量輸注泵給予 CGRP 3 μg/kg(30 min內輸注完畢)，隨后給予CGRP 6 μg/kg持續輸注維持12 h〔9〕，CGRP 購自 Sigma 公司。

1.2 標本采集及檢測方法

在腦死亡12 h時點留取肺組織，硫代巴比妥鈉法測定肺勻漿中丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法測定肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，MDA、SOD檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。采用RT-PCR方法檢測肺組織中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA水平。γ-GCS引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成：上游引物為：5'-TAA TCT TGC CTC CTG CTG T-3';下游引物為：5'-CTT CCT GGA AAC TTG CCT C-3';擴增片段長度約為122 bp。退火溫度52℃。內參GAPDH引物：上游引物為：5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3';下游引物為：5'-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3';擴增片段長度約為568 bp。退火溫度58℃。產物置于20 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠圖像分析儀下測目的基因及內參照吸光度值并攝像，將內參引物GAPDH的吸光度值設定為標準數1，γ-GCS與其所對應的GAPDH比為標準值(相對表達量)即為最后的γ-GCS基因相對含量。采用免疫印跡方法測肺組織γ-GCS蛋白表達，暗室曝光顯色后拍照，然后掃描至計算機，使用圖像分析系統計算待測條帶的吸光度×面積，與其內參照的吸光度×面積的比值作為其蛋白質表達水平的相對指標。γ-GCS抗體購自圣克魯斯生物技術公司。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 肺組織MDA含量及SOD活性

組高于A組及C組，C組高于A組(均P＜0.05)，肺組織SOD活性B組低于A組及C組(均P＜0.05)。見表1。

2.2 大鼠肺組織 γ-GCS mRNA及蛋白表達比較

肺組織γ-GCS mRNA水平B組、C組均較A組升高，C組較B組升高(均P＜0.05)。肺組織γ-GCS蛋白水平B組較A組降低，C組較B組、A組增高，組間比較差異均有統計學意義(均P＜0.05)。見表 1、圖 1、圖 2。

肺組織中MDA含量B

表1 各組動物肺組織中MDA含量、SOD活性、γ-GCS mRNA及蛋白表達水平比較(n=5s)

表1 各組動物肺組織中MDA含量、SOD活性、γ-GCS mRNA及蛋白表達水平比較(n=5s)

與A組比較：1)P＜0.05;與B組比較：2)P＜0.05

組別MDA(μmol/g prot)SOD(kU/g prot) γ-GCS mRNA γ-GCS 蛋白A組 1.12±0.41 129.48±11.792)0.17±0.01 0.05±0.01 B組 3.78±0.471) 103.27±13.82 0.19±0.011) 0.03±0.011)C組2.68±0.511)2)137.58±12.652)0.32±0.041)2)0.11±0.031)2)

圖1 各組γ-GCS mRNA水平

圖2 各組γ-GCS蛋白表達水平

3 討論

腦死亡后肺組織中MDA含量升高及SOD活性水平下降，說明腦死亡后OS反應增強，抗氧化能力減弱。OS本質是機體的一種基本的自我保護機制，參與體內炎癥、免疫、增殖、細胞再生、修復等多種重要生命過程的調節。OS多發生在機體遭受各種有害刺激時，正常生理條件下，體內氧化和抗氧化系統保持動態平衡，機體的抗氧化系統，如SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化酶等，可以及時快速清除體內過剩的ROS。如果氧化應激反應失控，抗氧化酶表達不足，體內氧化與抗氧化作用失衡，抗氧化作用不足而氧化作用過強，就極可能導致細胞凋亡和組織發生不同程度損傷〔10～12〕。腦死亡作為一種嚴重的傷害性刺激，啟動了機體的氧化應激系統，導致腦死亡大鼠肺組織氧化和抗氧化平衡發生了改變。

本實驗結果顯示腦死亡大鼠γ-GCS mRNA水平升高但γ-GCS蛋白水平下降，說明腦死亡應激后的γ-GCS mRNA水平較對照組有一定程度代償性升高，mRNA和蛋白水平是一個相偶聯的過程，但是兩者沒有必然一致的趨勢，細胞核相應 mRNA的合成速度，細胞質相應mRNA的降解速度對蛋白的濃度都會產生影響，可能因為抗氧化蛋白酶γ-GCS耗竭大于生成，所以γ-GCS蛋白水平下降。γ-GCS是核因子E2相關因子2(Nrf2)驅動的靶基因〔13〕，是受Nrf2-抗氧化反應元件(ARE)信號通路轉錄調節的抗氧化蛋白之一〔14〕，而Nrf2具有多器官保護作用〔15〕，如Nrf2可通過增加解毒和抗氧化能力保護肺臟抵御二丁基羥基甲苯誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、高氧損傷和博來霉素介導的肺纖維化〔16〕。谷胱甘肽(GSH)是細胞內最重要的抗氧化劑，對糾正氧化失衡，保護肺組織免受氧化損傷起關鍵作用;對保持氣道上皮細胞完整性，抵御肺部損傷與炎癥等方面非常重要〔17〕。內源性谷胱甘肽主要存在于胞漿內，γ-GCS是其合成的關鍵限速酶，調控GSH生成的速度和量〔18〕。γ-GCS蛋白表達降低，谷胱甘肽合成減少，就會導致局部肺組織氧化/抗氧化系統失衡〔19〕。γ-GCS表達上調，抗氧化作用增強則對肺組織損傷有保護作用〔20〕。

CGRP是一種由辣椒素敏感的感覺神經末梢釋放的神經遞質，在體內有廣泛的分布和表達，有內皮細胞保護作用、肺損傷保護作用等多種生理功能。CGRP作為神經元鈣調蛋白依賴激酶cAMP反應元件結合蛋白的調節因子，可以調節p38 MAPKNF-κB級聯反應。另外，CGRP可能通過抑制p38 MAPK磷酸化抑制H2O2誘導的Nox4表達，進而降低強活性氧的產生發揮保護內皮的作用〔10〕。Schaeffer等〔11〕的研究還表明：CGRP 是通過調節MAPK，ERK1/2和P38的蛋白激酶的激活拮抗氧化應激誘導細胞凋亡。本實驗顯示腦死亡大鼠γ-GCS蛋白表達水平下降，機體抗氧化保護功能下降，促進了腦死亡后肺損傷的發展，采用CGRP干預治療后腦死亡大鼠體內抗氧化物酶γ-GCS水平上升、SOD活力顯著升高，表明CGRP可能通過升高γ-GCS水平促進機體抗氧化功能的升高而起到肺保護作用。

綜上所述，腦死亡可導致大鼠肺組織氧化應激反應增強，CGRP可通過升高γ-GCS水平抑制腦死亡大鼠氧化應激反應。

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R56

A

1005-9202(2012)23-5186-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.039

河南省衛生科技創新人才工程項目(4088);河南省醫學科技重大攻關項目(200902019)

1 本院麻醉科 2 本院外科

蔣軍廣(1963-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事呼吸疾病的基礎及臨床研究。

苗麗君(1970-)，女，副教授，副主任醫師，碩士生導師，在讀博士，主要從事呼吸疾病的基礎及臨床研究。

〔2012-06-25收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曲 莉)