NF-κB和Cx32在肝細胞癌中的表達

羅愛華 黃小敏 曾湖 李雄

細胞間隙連接是普遍存在于組織中的一種細胞連接形式，通過Cx介導的細胞間連接通訊，對細胞的增殖、分化進行調控。間隙連接由相鄰細胞膜上的連接子相互銜接而成，連接子的蛋白質亞單位即間隙連接蛋白。間隙連接功能缺陷可能是腫瘤發生的重要環節。研究Cx32在正常肝中的表達，進一步探討與肝細胞性肝癌發生的關系［1］。采用免疫組織化學探討NF-κB和間隙連接蛋白Cx32在肝細胞癌組織中的表達特征。分析其表達與肝癌臨床病理特點之間的關系，檢測NF-κB與Cx32表達水平有助于判斷肝癌惡性程度和預后。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我科2007～2010年間肝細胞癌手術標本48例，平均年齡45.4歲，正常肝組織為肝膽管結石切除肝組織12例。根據2000年WHO消化道腫瘤肝癌分類標準進行分類。肝細胞癌分為4級，Ⅰ級2例，Ⅱ級32例，Ⅲ級8例，Ⅳ級6例。

1.2 免疫組化染色和判斷標準 送檢標本取材制片，切片脫蠟至水，高溫高壓法5 mi抗原修復。修復后阻斷內源性過氧化物酶，用PBS作為陽陰性對照，PBS水洗后加一抗，4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。SP試劑盒為上海太陽生物公司產品。染色結果判定標準:采用半定量法評估組織免疫組反應強度和陽性細胞率。細胞核和/(或)胞漿著色最深為3分，無色為0分，兩者之間為1或2分。每張切片選擇10個典型視野，將免疫反應的平均強度視為此例的免疫反應強度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，分別采用多因素方差(MANOVA)分析、Kruskal-Wallis H檢驗和Nemenyi檢驗，P＜0.05有統計學意義。

表1 Cx32蛋白在HCC及正常肝中陽性率

2 結果

2.1 Cx32蛋白的表達 分別檢測每例標本Cx32蛋白的表達，陽性染色表達定位于胞漿和胞膜上，肝硬化組織中胞漿陽性為主88.91%(11/12)，反應強度高。Cx32在HCC組織中有不同程度的表達。HCC陽性細胞以胞漿內彌漫、均勻分布為主，也可見胞膜陽性，染色較淡。經χ2檢驗，Cx32在HCC中陽性率明顯低于其在肝正常組織的陽性率(P＜0.01)，隨著HCC分化程度降低，其陽性率有所下降，比較結果見表1。

2.2 NF-κB蛋白的表達 陽性染色表達定位于胞核，本研究結果顯示，NF-κB在正常肝組織及HCC組織中表達分別為21.34%(3/12)，71.28%(34/48)(P ＜0.01)。同時 NF-κB 在高中低分化HCC組織中的表達率有顯著差異(P＜0.05)并與臨床TNM分期顯著相關(P＜0.05)，表明肝細胞癌的發生、發展與NF-κB的高表達有顯著相關性，提示NF-κB活化后，進入胞核，通過抑制細胞的調亡從而調控腫瘤的生長，調節下游基因的轉錄，促進肝癌的發生。

3 討論

細胞間隙連接是相鄰細胞之間形成的一種能夠開放和關閉的親水性膜通道結構，由跨膜的細胞間隙連接蛋白(connexin，Cx)構成，只能透過相對分子質量通道的直徑約為1.5～2.0＜1000的分子和離子，如Ca2+、cAMP、三磷酸肌醇、葡萄糖、維生素及其他參與生長調節的物質可以通過間隙連接為相鄰細胞所共有，而蛋白質、RNA、多糖和脂質復合物等大分子物質則不能透過間隙連接通道，不同組織、細胞之間通過間隙連接，進行信息溝通，平均代謝產物，使各種信息有效的達到相應的細胞，保持細胞群體對生長刺激和調節反應的同步性，使細胞的增值、分化按正常的程序進行［2-4］。Mesnil M［5］研究表明，用Cx基因轉染腫瘤細胞，使其重建細胞間隙連接，恢復GJIC可以延緩腫瘤細胞生長。在Warn-Cramer［6］的實驗中，Martyn將CxcDNA轉染至小鼠永生化細胞后，并為建立功能性細胞間隙連接通訊，但仍然抑制細胞增殖。本研究表明，Cx32在肝細胞及HCC細胞中均存在不同程度的表達，既定位于胞漿內，又有胞膜陽性，或二者同時陽性，與國外文獻報道相符合。研究發現，Cx32在正常肝細胞中有較高水平的表達(88.91%)，陽性細胞深染。在HCC組織低表達(37.50%)，且染色強度明顯減弱。Cx32的表達減弱與正常肝、至HCC的惡性進程密切相關。

研究同時對Cx32在HCC及其癌旁肝中的表達進行了分析，發現Cx32在二者中的表達陽性率明顯不同。癌周肝細胞的高強度表達與HCC細胞淡染甚至無陽性染色，形成明顯對比，顯示癌旁肝細胞與肝癌細胞間生物性質不同。進一步證實Cx32表達異常與HCC的形成及其惡性特征有關。

在不同分化的HCC組織中，Cx32的表達也存在差別，在HCCⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級中的陽性率分別為 100%、40.62%、25.20%、16.66%，(P＜0.01)，提示分化程度降低，Cx32的表達水平逐漸下降，表達率有顯著差異。

現有同類研究已明確，間隙連接通訊功能的缺陷以間隙連接基因表達的異常為基礎，從而對腫瘤的惡性增殖和轉化進行調控。對細胞生長、增殖、分化、維持內環境穩定等起著重要的調節作用［7］。有認為Cx32基因的穩定表達可能有抑瘤用，可能具有重要抑癌因基。本研究提示，Cx32表達下降可能是HCC的發生的重要環節，其分子機制尚需研究。NF-κB在正常肝組織及HCC組織中表達分別為21.34%(3/12)，71.28%(34/48)(P＜0.01)。同時NF-κB在高中低分化HCC組織中的表達率有顯著差異(P＜0。05)并與臨床TNM分期顯著相關(P＜0.05)，表明肝細胞癌的發生、發展與NF-κB的高表達有顯蓍相關性，同時檢測NF-κB與Cx32表達水平有助于判斷肝細胞癌惡性程度和預后。

［1］Karin M．NF-kappa B and cancer:mechanisms and targets．Mol Carcinog，2006，45(6):355-361．

［2］Karin M，Ben-Neriah Y．Phosphorylation meets ubiquitination:the control of NF-KB activity．Annu Rev Immunol，2000，l8(1):621-663．

［3］Konstantinopoulos PA，Vandoros GP，Sotiropoulou-Bonikou G，et al．NF-kappa B/PPAR gamma and/or AP-1/PPAR gamma＇on/off＇switches and induction of CBP in colon adenocarcinomas:correlation with COX-2 expression．International Journal of Colorectal Disease，2007，22(1):57-68．

［4］Baldwin AS．Series introduction:the transcription factor NF-kappa B and human disease．J Clin Invest，2001，107(1):3-6．

［5］Mesnil M.Connexins and cancer.Biol Cell，2002，94:493-500．

［6］Warn-Cramer BJ，Lin R，Martyn K，et al．Maintaining connexin 43 gap junctional communication in v-Src cells does not alter growth properties associated with the transformed phenotype.Cell Commun Adhes，2003，10:299-303．

［7］Tano T，Fujinoto E，Habiwara H，et al.Connexin 32 as an anti-invasive and anti-metastatic gene in renal cell carcinoma．Biol Pharm Bull，2006，29(10):1991-1994．