對氧磷酶2基因多態性與腦梗死的相關性研究

張慎韜，李東芳，張華屏，裴宇恒，連 霞，劉彩玉

對氧磷酶（paraoxonase，PON）是一種有機磷三酯化合物水解酶，該酶可水解、中和導致動脈粥樣硬化的特定脂質過氧化物，保護細胞膜不被脂質過氧化物破壞［1］。腦梗死作為一種血栓、動脈粥樣硬化相關性疾病，在其發病過程中理論上可因PON2基因突變導致相應酶的功能缺損而加劇腦梗死的進程。近年研究表明，PON2S311C多態性與冠心病［2］、2型糖尿病有關［3］，與胃腸疾病相關［4］，但與腦梗死的相關性尚無確切定論。本研究旨在了解這一基因多態性在山西漢族人群的分布頻率，同時探討PON2基因多態性是否為腦梗死發病的危險因素。本實驗瀏覽人類單倍體圖計劃（HapMap）［5］，選取PON2標簽SNP（tag SNPs）rs17876171單核苷酸多態性位點進行研究，探討該點突變導致的多態性與腦梗死發病的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1月—2011年4月在山西醫科大學第二醫院神經內科就診的腦梗死患者及部分健康體檢人員的臨床資料和外周血標本。對象均為山西地區漢族人，并簽署知情同意書。病例組：首發急性腦梗死患者110例，其中男65例，女45例；年齡（58.2±10.5）歲。研究對象均有完整的臨床資料，并符合1986年WHO腦卒中診斷標準以及1995年中華醫學會全國第四屆腦血管病學術會議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點》，均經頭顱MRI＋MRA＋DWI證實有新鮮的梗死灶及顱內動脈閉塞或狹窄。此外還排除了風濕性心臟病、房顫、感染性心內膜炎等可引起繼發性腦栓塞的情況，以及冠心病、心肌缺血、2型糖尿病。正常對照組：同期在我院接受健康體檢人群100名，其中男57名，女43名；年齡（56.85±11.33）歲。對照組的年齡、性別與病例組相匹配，并除外顱內、外動脈閉塞性病變、冠心病、心肌梗死、糖尿病等。

1.2 主要試劑及儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP購自Fermentas公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；限制性內切酶DdeI購自Fermentas公司；DL2000DNA Marker購自大連寶生物公司；主要儀器由美國Bio-Rad公司的PTC200型PCR擴增儀、北京六一科技有限公司的垂直電泳槽、電泳儀和凝膠成像系統等組成。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本收集 所有被檢者均禁食12h～14h，晨起空腹抽取靜脈血4mL～5mL，EDTA抗凝。其中2mL置于-80℃保存，用作DNA提取；另3mL靜脈血分離血清測定三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和血糖水平，并且記錄入院時未服降壓藥時的血壓情況，詳細詢問有無吸煙史、飲酒史及腦卒中家族史。

1.3.2 DNA提取 按酚-氯仿抽提取法，提取外周血中白細胞內的DNA，溶于TE溶液中，置-20℃冰箱保存。

1.3.3 PCR擴增 所用引物序列參考文獻［3］，并由上海生工生物工程公司合成。上游引物5′-ggaaaacagggcttattgatga-3′，下游引物5′-ctgggtcaatgttgctggttaaa-3′。PCR反應體系：包含1×PCR緩沖液（10mmol／L ris-HCl，50mol／L KCl，1.5mol／L MgCl2），200 μmol／L dNTP，上 下 游 引 物 各 100nmol／L，DNA200ng，Taq DNA聚合酶1U。反應條件：94%預變性5 min，然后按94℃40s、50℃40s、72℃90s共35次循環，最后72℃至10min。PCR結束后取10μL PCR產物行20g／L瓊脂糖凝膠電泳（含0.5mL溴化乙錠），5V／cm電泳40min，在紫外燈下觀察PCR擴增結果。

1.3.4 酶切反應 PCR擴增產物經限制性內切酶DdeI消化后，行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，60V電泳1h～2h，最后經0.5μg／mL溴化乙錠染色，直至DNA條帶顯色為止。拍照觀察、保存并分析結果。PON2產物片段總長度為331bp，經內切酶消化后，可出現3種片段的組合，分別為：128bp、105bp、67bp、31bp（CC 基 因 型）；172bp、128bp、31bp（GG 基 因 型）；172bp、128bp、105bp、67bp、31bp（CG基因型）。

1.4 統計學處理 應用Hardy-Weinberg（H-W）分析法，檢驗兩樣本的群體代表性。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較應用t檢驗和方差分析。兩組間基因型及等位基因頻率比較采用卡方檢驗。腦梗死的危險因素使用非條件Logistic回歸方法分析。

2 結 果

2.1 H-W平衡分析結果 對SNPs rs17876171位點進行擬合優度檢驗，腦梗死組（χ2=2.352）和對照組的（χ2=1.342），腦梗死組與對照組基因型及等位基因頻率分布沒有偏離H-W平衡（P＞0.05），表明兩組受檢者均來自于同一群體，達到遺傳平衡。

2.2 兩組受檢者的一般資料 腦梗死組和對照組年齡、性別、空腹血糖、飲酒史差異無統計學意義（P＞0.05）。但腦梗死組患者的吸煙史、收縮壓、舒張壓、卒中家族史、TC、TG、HDL-C、LDL-C，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.3 基因型和等位基因頻率分布 腦梗死組基因型和等位基因頻率分布與對照組相比均有統計學意義（P＜0.05）。腦梗死組G等位基因頻率為20.4%，對照組為13.0%，兩組間差異有統計學意義（χ2=4.14，P＜0.05）。攜帶G等位基因的基因型（GC＋GG）與CC基因型比值比OR=2.15（1.25～3.70）。詳見表2。2.4 多元Logistic回歸分析 將腦梗死組作為自變量，以上述檢驗、方差分析和卡方檢驗所得有統計學意義的TG、TC、HDL-C、LDL-C、收縮壓、舒張壓以及攜帶G等位基因的基因型作為因變量，經過多元Logistic回歸分析顯示，收縮壓、TG、吸煙史、GC＋GG的回歸系數b為正值；而HDL-C為負值。詳見表3。

表2 兩組基因型頻率、等位基因頻率比較 例（%）

表3 Logistic回歸分析結果

3 討 論

本研究立足于山西地區人群，采用病例對照研究，選取PON2標簽位點tagSNP rs17876171，探討該點突變（C→G）導致的基因多態性與腦梗死關系。本研究結果提示，腦梗死組PON2rs17876171位點G等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。腦梗死組攜帶G等位基因的GG、GC基因型與CC基因型的相對危險度OR=2.15。經多元非條件Logistic回歸分析顯示，TG的OR值為6.781，95%CI（2.663，17.266）；收縮壓的OR 值為1.426，95%CI（1.097，1.853）；吸煙史的OR值為1.988，95%CI（1.239，3.190）；GC＋GG的OR 值為2.179，95%CI（1.527，3.108）。因此，TG、血糖、收縮壓和攜帶G等位基因為腦梗死的危險因子。

PON是一類Ca2＋依賴性高密度脂蛋白相關脂酶，目前已發現有3個家族成員，包括PON1、PON2和PON3。PON2位于人類7號染色體長臂q21.3，包括9個外顯子和8個內含子。該基因編碼區在2個位點具有多態性，分別是148位丙氨酸（alanine，A）／甘氨酸（glycine，G）和311位半胱氨酸（cysteine，C）／絲氨酸（serine，S）［6］。在梗死形成過程中，PON 可以防止氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）生成，水解脂質過氧化物，并清除存在于ox-LDL中的致炎性氧化型脂質，發揮抗動脈粥樣硬化作用［7］，進而干預腦梗死的形成。最新研究表明PON2可以阻止線粒體內過氧化物的形成以及抑制細胞凋亡，進一步在分子水平闡述了PON2抗動脈硬化的機制［8］。目前研究較多的是PON1基因，但相比PON1僅在肝臟中表達，PON2的表達更為廣泛，在多個組織中均有表達，并在動脈壁細胞，包括上皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞以及細胞核周、線粒體、內質網中均被檢測出來［9，10］。研究發現PON2基因敲除后的小鼠，相對野生型小鼠體內環境氧化壓力升高、炎性反應加劇，動脈粥樣硬化程度增大［7］。有學者認為PON2可在細胞水平發揮抗氧化作用，與血管內皮細胞的損傷及動脈粥樣硬化關系更為密切，所以更具研究潛質。

Slowik等［2］研究認為PON2基因多態性與大血管病變有關，目前該基因與冠心病的相關性已有廣泛的研究，但其與腦血管疾病之間的關系尚未完全明確。一項研究中報道PON2 311CC基因型在存在冠狀動脈三支病變的人群中有著比較高的頻率［11］，而本實驗結果提示G基因型（PON2 311C）是腦梗死的危險因素。這可能是由于腦梗死與冠心病的具有相同的發病機制，均是由動脈粥樣硬化發展所致，所以出現該基因在腦梗死人群與冠心病人群中相同的結果。但本次的研究結果與英國學者Alireza等［6］的研究結論并不一致。這種差異可能源于等位基因出現的頻率不僅受到基因多態性間的連鎖不平衡影響，還存在著種族差異及環境等多因素的影響，且由于樣本數量有限所導致。

本研究結果提示山西漢族地區攜帶PON2S311CG等位基因的人群發生腦梗死的風險增高。但尚需進一步擴大樣本量和采樣范圍，以進一步證實該位點突變在腦梗死中的價值。期望通過檢測PON2 311位等位基因篩選腦梗死高危人群，為腦梗死的預警提供新的線索。

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