副豬嗜血桿菌OMP2基因的克隆及蛋白結構預測

劉 建，湯德元*，羅險峰，曾智勇，李春燕，甘振磊，王 鳳，郝 飛，王洪光

（ 1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008）

副 豬 嗜 血 桿 菌（Haemophilus parasuis，HPS）是健康豬上呼吸道常見的一種細菌，主要定植在鼻黏膜和（或）扁桃體區域[1]，在受到外界刺激下，HPS 可以突破鼻黏膜的屏障遷移到肺部，造成肺炎，而且會進一步的傳播導致嚴重的全身性疫病，主要以纖維素性多發性漿膜炎、關節炎、腦膜炎為特征，咬肌炎較少見[2-3]，這種病被稱為副豬嗜血桿菌病或格拉澤氏病。副豬嗜血桿菌只感染豬，主要發生在斷奶前后和仔豬階段，多見于5～8 周齡的仔豬，一些應激因素，如長距離運輸，惡劣的飼養的環境以及哺乳仔豬斷奶過早等，對副豬嗜血桿菌的流行有一定影響[4]，該病發病率一般在10%～15%，嚴重時死亡率則高達50%[5]。HPS 是導致規模化養豬廠仔豬發病死亡的主要原因之一，在過去的幾年里，給現代化養豬業造成了重大的經濟損失[6]。外膜蛋白（Outer-Membrane Protein，OMP）、莢膜多糖、脂多糖、神經氨酸酶、轉鐵結合蛋白、毒素蛋白等都是HPS 的主要毒力因子[7]，均可導致機體發病。通過對完全獲得HPS 免疫保護的動物研究發現，機體并未產生針對脂多糖和莢膜多聚糖的抗體，僅產生了具有中和外膜蛋白作用的抗體，證明外膜蛋白具有更強的免疫原性。本實驗通過PCR 技術擴增HPS 的OMP2 基因，應用生物信息學軟件對OMP2 基因及其編碼的蛋白質進行結構及功能的分析，為研制檢測 HPS 抗體的間接 ELISA 試劑盒以及 HPS 基因工程疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、感受態細胞和載體

副豬嗜血桿菌陽性病料采自貴州省安順地區某規模化養豬場，經PCR 鑒定為陽性及間接血凝試驗鑒定為血清型5 型后，-20℃保存；pMD18-T Vector 購自大連寶生物工程有限公司；基因工程菌E.coliTop10 感受態細胞，本實驗保存。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、Rnase Free H2O、BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ限制性內切酶、DL2000 DNA Marker、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；Amp、IPTG、X-gal 購于美國Sigma 公 司；GoldView 購于Hyclone公司；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit DNA 凝膠回收試劑盒和E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit 質粒提取試劑盒購自OMEGA 公司；瓊脂糖，購自Biowest公司；其他化學試劑均為國產分析純產品。

1.3 引物設計與合成

根據副豬嗜血桿菌SH0165株OMP2 基因序列(登錄號：NC_011852)，用生物軟件Premier Primer5.0 和Oligo6.0 軟件設計1對特異性引物，擴增HPS OMP2 的全基因。引物序列如下：上游引物P1:5′-CGGGATCCATGAAAAAA ACACTAGTAGCA-3′ (下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)；下游引物P2:5′-GCGTCGACTTACCATAAT ACACGTAAACCA-3′(下劃線部分為SalⅠ酶切位點)，預計擴增基因片段大小為1092 bp。引物由大連寶生物公司合成。

1.4 副豬嗜血桿菌OMP2 基因的擴增

用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 提取試劑盒提取副豬嗜血桿菌陽性病料基因組DNA，以此為模板，以P1 和P2 為引物，進行PCR 擴增。PCR 反應體系如下：10×PCR Buffer （含Mg2+）5μL、dNTP Mixture( 各2.5mM) 4μL、 上下游引物各2μL、Taq DNA 聚合酶1μL、DNA 模板4μL、加Rnase Free H2O 至總體積為50μL。PCR 反應條件 為：94℃預 變 性5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，共35 個循環，最后72℃延伸10 min。

1.5 副豬嗜血桿菌OMP2 基因的克隆與鑒定

將回收純化的OMP2 基因與pMD18-T 載體連接，連接反應體系為：pMD18-T 載 體1μL、目的DNA 片 段3 μL 和Solution Ⅰ6 μL，16℃連接過夜，連接產物轉化E.coliTop10 感受態細胞，涂布于含IPTG和X-gal 的2×YT 瓊脂平板（含 氨芐青霉素50 μg/mL）上，37℃恒溫培養12～16 h，挑取單個白色菌落接種于2×YT 液體培養基（含氨芐青霉素50μg/mL） 中，37℃ 180 r/min振蕩培養16～18 h，提取質粒DNA，經 BamH I 和Sal Ⅰ雙酶切鑒定正確后，將陽性克隆質粒命名為pMD18-T-OMP2，并送上海英駿生物技術公司測序。

1.6 副豬嗜血桿菌OMP2 基因編碼蛋白的生物信息學分析

利用 DNAMAN、MEGA、DNAStar 軟件及互聯網上的分析軟件，對所克隆的OMP2 基因進行核苷酸序列、編碼的氨基酸序列、蛋白分子理化特性征、信號肽、跨膜區、抗原表位及蛋白結構進行預測分析。

2 結果

2.1 OMP2 基因擴增結果

PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶約為1092 bp（圖1），與預期片段大小相符。

圖1 OMP2 基因的PCR 擴增結果

2.2 重組質粒雙酶切鑒定結果

將回收純化的后的PCR 產物與pMD18-T 載體連接，篩選的陽性重組克隆質粒pMD18-T-OMP2 經BamHI和SalⅠ雙酶切鑒定后可見與預期大小相符的條帶（圖2）。

圖2 重組質粒pMD18-T-OMP2 雙酶切鑒定結果

2.3 副豬嗜血桿菌OMP2 基因的核苷酸序列分析

經序列測定分析表明，擴增出的基因片段全長為1092 bp，編碼363個氨基酸，與GenBank 所登錄的副豬嗜血桿菌SH0165 株基因組(登錄號：NC_011852)對應的OMP2 基因核苷酸序列同源性99.8%，其中本實驗測序的副豬嗜血桿菌OMP2 基因在175 位和177 位發生了堿基突變，分別由T →C和A →G，但編碼的氨基酸序列并未發生變化，同源性為100%。

2.4 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白分子特征

應 用DNAMAN 和ExPASy 服務器上的ProtParam 軟件（http://web.expasy.org/protparam/） 對副豬嗜血桿菌OMP2 基因編碼的外膜蛋白P2 分子特征進行分析，推導出的外膜蛋白P2 原子總數為5463，分子式C1733H2700N482O546S2，分子質量為39087.45 Daltons（道爾頓），含有47個強堿性氨基酸（K、R)、38 個強酸性氨基酸(D、E)、114 個疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、106 個極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)；等電點pI 為9.21；半衰期為30h（體外哺乳類網狀細胞）、大于20h（酵母體內）、大于10h（大腸桿菌體內）；不穩定系數為16.73，推測OMP2 外膜蛋白為穩定性蛋白；脂肪指數為70.63，總體平均親水性為-0.494。

2.5 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白的二級結構預測

應用DNAStar中的Karplus-Schulz 方法預測OMP2 外膜蛋白的柔性 區 域，Garnier-Robson 和Chou-Fasman 方法預測OMP2 外膜蛋白的α-螺旋、β-折疊、β 轉角和無規則卷曲（圖3）。結果可見OMP2 外膜蛋白的柔性區域位于24～35，41～65，4～76，83～97，99～105，120～121，127～132，135，141～146，149～156，161～166，173～177，188～204，216～221，230～240，243～248，266～268，273～281，286～287，293～298，305～311，329，336～352區段，呈現出散在分布。

2.6 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白的抗原表位預測

應 用DNAStar 中 的Kyte-Doolittle 方法預測OMP2 外膜蛋白的親水區，Jameson-wolf 方法預測OMP2外膜蛋白的抗原指數，Emini 原則預測OMP2 外膜蛋白可能的抗原表位，綜合以上各種預測方法表明OMP2 外膜蛋白可能的抗原表位區為N 端第23～35 位、42～63 位、73～105 位、147～157位、229～249 位、186～201 位、304～313 位、340～351 位（圖4）。

圖 3 根據2 種不同的方法預測副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白的二級結構

圖4 OMP2 外膜蛋白親水性位點、抗原指數和表面可能位點預測結果

2.7 副豬嗜血桿菌OMP2 的信號肽和跨膜區預測

利用SignalP 軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 對HPS OMP2 基因編碼的蛋白序列進行信號肽預測，利用神經網絡(NN)和隱馬爾可夫模型(HMM)兩種方法進行預測。結果顯示，副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白序列最前端的19個N-末端氨基酸殘基為信號肽序列，最佳切割位點在19～20 個氨基酸，機率為0.933，且信號肽區域主要為疏水性氨基酸（圖5 和圖6）；而生 物 學 軟 件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測結果表明，OMP2 外膜蛋白無跨膜區。

圖5 神經網絡法(NN)預測OMP2 外膜蛋白信號肽（Signal P）結果

圖6 隱馬爾可夫模型(HMM)預測OMP2外膜蛋白信號肽（Signal P）結果

2.8 副豬嗜血桿菌OMP2 外膜蛋白結構預測

通過PredictProtein 軟件（https://www.predictprotein.org/） 預 測，OMP2 外膜蛋白可能含有4 個N-糖基化位點、1 個cAMP 和cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點、8 個蛋白激酶C 磷酸化位點、7 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點、1 個酪氨酸激酶磷酸化位點、9 個N-肉豆蔻酰化位點。

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬呼吸道的一種常在菌，在豬群受到應激或者感染其他疾病的情況下容易導致該病的流行。隨著規模化養豬業的不斷發展，HPS 與其他細菌或病毒混合感染的趨勢也日益嚴重，所以建立一種特異和快速的用于檢測HPS 的診斷方法以及研制預防HPS 新型高效安全的疫苗具有重要的意義。本研究運用PCR 技術成功地擴增了HPS 的OMP2 基因，序列測定表明該基因全長1092bp，編碼363 個氨基酸，與GenBank 所登錄的副豬嗜血桿菌SH0165 株對應核苷酸序列同源性為99.8%，氨基酸序列同源性為100%；該蛋白不穩定系數為16.73，推測其為穩定性蛋白；對OMP2 基因編碼的OMP2外膜蛋白二級結構預測分析，結果顯示OMP2 基因含有α-螺旋、β-折疊、β 轉角和無規則卷曲，柔性區域呈散在分布，而且具有較多的親水性區域，是一種親水性蛋白；信號肽預測結果顯示，OMP2 外膜蛋白序列最前端的19 個N-末端氨基酸殘基為信號肽序列，最佳切割位點在19～20 個氨基酸，機率為0.933，且信號肽區域主要為疏水性氨基酸，由于疏水區的存在不利于蛋白的表達，所以去掉信號肽序列有利于外膜蛋白的表達；跨膜區預測結果表明，OMP2 外膜蛋白無跨膜區，提示該蛋白可能實現較高量及可溶性的表達；對OMP2 外膜蛋白結構預測顯示，該蛋白可能含有4 個N-糖基化位點、1 個cAMP 和cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點、8 個蛋白激酶C 磷酸化位點、7個酪蛋白激酶II 磷酸化位點、1 個酪氨酸激酶磷酸化位點、9 個N-肉豆蔻酰化位點。以上分析結果表明，OMP2 基因編碼的OMP2 外膜蛋白是一種具有前導信號肽的分泌型蛋白，而且推測出的多個修飾性位點可能對其前體蛋白的加工或生物功能具有重要的調節作用。

近年來的研究表明，革蘭氏陰性細菌的外膜蛋白在細菌的致病過程中起著十分重要的作用。由HPS 的OMP2 基因編碼的OMP2 外膜蛋白，是HPS 一種重要的毒力因子，也是一種具有免疫顯性的膜孔蛋白，作為一種膜孔蛋白，OMP2 外膜蛋白在由煙酰胺衍生的核苷酸底物的一般擴散和特定運輸均起到一定的功能，而且對不同血清型的副豬嗜血桿菌株都具有相當程度的抗原異質性，所以可以預測如果用OMP2 基因的表達產物建立的ELISA 診斷方法應該可以檢測HPS 所有的血清型，李淼等[8]建立了基于重組HPS OMP2 外膜蛋白的檢測檢測HPS 抗體的間接ELISA方法，結果該方法對于國內外廣泛流行的 4，5，12，13 四種血清型HPS 均具有交叉反應，而對其他幾種常見的豬病毒和細菌病原均為陰性反應，表明該方法具有良好地特異性。在副豬嗜血桿菌病的診斷中，目前雖然已有用全菌裂解抗原或莢膜多糖抗原建立的ELISA 檢測方法的報道，但其特異性不強[9-10]。此外，對流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）OMP2 外膜蛋白的研究表明，OMP2 外膜蛋白在HPS 定植以及與人黏蛋白特定組分結合的過程中可能發揮一定的作用，而且OMP2 外膜蛋白在通過煙酰胺衍生的核苷酸底物定植在人的呼吸道上是相對穩定的。因此，OMP2 外膜蛋白被認為是一種潛在的疫苗候選株。本實驗通過對副豬嗜血桿菌OMP2 基因的擴增、克隆以及生物信息學分析，為進一步深入研究OMP2 基因提供了理論基礎。

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