冠心病痰證與載脂蛋白A5c.553G＞T基因多態性的關系研究1）

聶 婭，周小青，蘭紅勤，黎鵬程，郭春秀

冠心病發病與多種易感基因有關。痰證是冠心病臨床常見的中醫證型，但有關冠心病痰證與APOA5c.553G＞T基因多態性的相關性研究尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 冠心病診斷符合1979年WHO制定的缺血性心臟病診斷標準。痰證辨證標準：參考《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語證候部分》（GB／T16751-2-1997）。非冠心病痰證主要選擇慢性支氣管炎、高血壓、高脂血癥等痰證病人。西醫診斷參照國際國內相關疾病診斷標準。健康對照組選擇性別、年齡與冠心病組相匹配者，經病史詢問無冠心病，體格檢查無陽性體征，心電圖、動態心電圖或運動心電圖未提示心肌缺血證據，胸部X片、肝腎功能、血尿常規檢查均無異常者。

1.2 研究對象 選擇2008年6月—2010年6月在湖南中醫藥大學附屬第一醫院住院及體檢中心體檢者。256例入選對象均為湖南地區無血緣關系的漢族人群，分為4組：①冠心病痰證組58例，年齡（63.86±9.32）歲，男39例，女19例；②冠心病非痰證組51例，年齡（63.04±8.80）歲，男33例，女18例；③非冠心病痰證組73例，年齡（62.37±6.58）歲，男52例，女21例；④健康對照組74例，年齡（62.19±6.63）歲，男44例，女30例。4組年齡、性別經分析無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器和試劑 PE480型PCR儀，M-15E紫外透射儀，Palariod攝影機。TaqDNA 聚合酶、RNAse、PUC18DNA／MspI、λDNA／hindⅢ、溴乙淀（北京天根生化科技有限公司），HaeⅢ內切酶（Fermentas）。

1.3.2 血樣采集 所有被檢者空腹12h后，于次日08：00測量身高、體重、血壓，并計算體質量指數（BMI）。采集靜脈血5 mL，其中2mL以2%EDTANa2抗凝，用于抽提基因組DNA。其余3mL于當日檢測血脂。

1.3.3 血脂檢測 采用酶法測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），采用化學遮蔽法直接測定高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）。以上檢測均在德國羅氏公司 MODULAR PP全自動生化分析儀上進行。

1.3.4 基因組DNA提取 采用十二烷基硫酸鈉及蛋白酶K消化，酚／氯仿提純，乙醇沉淀。

1.3.5 引物設計與合成 參考文獻［1］設計，正向引物5′-AGA CAC CAA GGC CCA GTT GCT GGG-3′；反向引物5′-ATG CCG CTC ACC AGG CTC TCG GCG-3′。由上海英駿生物技術公司合成。

1.3.6 PCR反應及限制性片段長度多態性分析 PCR反應總體系20.0μL：dd H2O 14.2μL，PCR Buffer（含 Mg2）2.0μL，dNTPs 0.5μL，正向引物、反向引物各0.5μL，DNA模板2.0 μL，DNA聚合酶0.3μL。PCR反應條件：96℃預變5min；96℃變性30min；58℃退火30s；72℃延伸30s，循環35次；末次循環后72℃延伸7min，最后保存于4℃。取PCR產物10.0 μL，以HaeⅢ限制性內切酶1.0μL，37℃水浴5h。酶切產物經含EB的3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，90V恒壓電泳1h，紫外燈下判斷結果并拍照記錄。并隨機抽取部分PCR產物送南京金斯特生物技術公司測序。

1.4 統計學處理 使用SPSS13.0分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析、LSD、Tamhane’s法。對符合正態分布的兩獨立樣本均數間比較用獨立樣本t檢驗。不符合者用t’檢驗。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度。計數資料使用卡方檢驗。相關基因型、危險因素與CHD痰證的相關性用Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1 研究對象臨床資料 各組在年齡、性別、吸煙史上無統計學意義，病例組與對照組具有可比性。CHD痰證組的BMI高于其他3組（P＜0.01），非CHD痰證組BMI明顯高于健康對照組（P＜0.01）；健康對照組收縮壓、舒張壓明顯低于其他3組（P＜0.01）；健康對照組TG明顯低于其他3組（P＜0.01），CHD痰證組LDL-C高于健康對照組（P＜0.01），這些數據進一步肯定了這些危險因素對CHD發病的重要影響。詳見表1。

表1 4組臨床資料比較

2.2 APOA5c.553G＞T基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗 256例受檢者中，c.553G＞T位點GG型221例（86.33%），GT型35例（13.67%），TT型0，G等位基因頻率93.16%，T等位基因頻率6.84%，經卡方檢驗，本研究中APOA5c.553G＞T基因型分布頻率的實際值與預計值差異不顯著（χ2=1.378，P=0.240），符合Hardy-Weinberg平衡。說明樣本來自一個較大的、處于隨機婚配平衡狀態的群體，具有一定代表性。

2.3 4組APOA5c.553G＞T基因多態性分布 4組相比，APOA5c.553G＞T多態性基因型及等位基因分布均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 4組APOA5c.553G＞T基因多態性分布

2.4 APOA5c.553G＞T不同基因型的血脂水平 對全部受試者APOA5c.553G＞T位點不同基因型的血脂水平進行比較，兩型間血清TG水平差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表3。

表3 全體對象c.553G＞T位點不同基因型間血脂水平（x±s）

2.5 APOA5c.553G＞T不同基因型與冠心病痰證發病風險的關系 首先根據病例-對照研究計算CHD痰證組與健康對照組間不同基因型的OR值，再將不同組別作因變量、以c.553GT、c.553GG、性別、年齡、吸煙史、舒張壓、收縮壓、BMI、血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）為自變量，進行Logistic回歸分析。結果顯示，c.553T等位基因攜帶者發生冠心病痰證的風險比野生型GG攜帶者增加了3.600倍，但在校正了年齡，性別、吸煙史、舒張壓、收縮壓、BMI、血脂等因素后，未顯示c.553GT是冠心病痰證的獨立危險因素。詳見表4。

表4 APOA5c.553G＞T不同基因型與冠心病痰證發病風險的關系

3 討 論

載脂蛋白是一類具有脂類轉運功能的血漿蛋白質，其結構與合成異常將影響血脂代謝，而血脂異常是動脈粥樣硬化和冠心病發生的重要危險因素。載脂蛋白 A5是2001年［1］在ApoA1／C3／C4基因簇中發現并證實的一個載脂蛋白家族新成員，ApoA5基因多態性與心腦血管疾病及代謝性疾病有一定關聯性且存在種族差異［1-3］。ApoA5基因存在13個單核苷酸多態位點，其中ApoA5c.553G＞T是由Kao等［2］發現，該多態性是由于基因編碼區第553位的堿基G突變為T，使第185位甘氨酸（glycine，G）轉變為半脫氨酸（cysteine，C），進而可能影響了蛋白功能。在本研究的256例受檢者中，c.553G＞T位點GG型221例（86.33%），GT型35例（13.67%），TT型0例，G等位基因頻率93.16%，T等位基因頻率6.84%，符合Hardy-Weinberg平衡。該多態位點的突變等位基因T的頻率相當低（在健康人群中僅為3.38%），本實驗中未發現1例TT型，可能與樣本大小及樣本本身差異有關，與Kao等［2］以及其他關于中國人群的報導相似［4-6］。而在白種人群中的報導結果T等位基因的頻率尚缺如［7］，因此該多態位點的分布亦有明顯的種族差異。

ApoA5c.553G＞T多態性與高 TG血癥有關［1，4，5］，但也有研究認為，除了與高TG血癥有關外，還與LDL-C升高或HDLC降低有關［4，6］。而本研究表明，c.553TG型血清TG水平明顯高于GG型（P＜0.01），而血清TC、LDL-C和HDL-C水平則沒有顯著差異。

本研究結果表明，冠心病痰證組與健康對照組相比，ApoA5c.553G＞T在基因型和等位基因頻率分布兩方面均有統計學意義。c.553T等位基因攜帶者發生冠心病痰證的風險比野生型GG攜帶者分別增加了3.600倍，但在校正了年齡，性別、吸煙史、舒張壓、收縮壓、體質量指數、血脂等因素后，未顯示c.553GT是冠心病痰證的獨立危險因素，這一結果可能與樣本量有限以及c.553T等位基因本身分布頻率太低有關，因此，ApoA5c.553G＞T基因變異作為冠心病痰證的獨立危險因素尚需更大樣本人群研究證實。

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