鱖魚肌球蛋白重鏈基因的原核表達及多克隆抗體的制備

劉希良，王開卓，成 嘉，蒙 濤，陳敦學，李玉瓏，張紅芳，張建社，褚武英

(1.長沙大學生物工程與環境科學系，中國 長沙 410003；2. 廣西師范大學生命科學學院，中國 桂林 541004；3.九江學院 生命科學系，中國 九江 332005)

肌球蛋白是肌肉主要構成蛋白質之一．它由Kuhne于1859年首先報道，之后于1864年在研究骨骼肌收縮時發現并命名[1]．肌球蛋白不僅是基礎蛋白收縮系統主要成分，也是一種復雜多聚體蛋白，在真核生物肌肉收縮過程中起到很關鍵作用[2-3]．在不同的動物種類之間，乃至魚類不同品種間，肌球蛋白結構和表達存在著種屬間差異性．大部分研究工作主要針對脊椎動物骨骼肌肉(主要是兔和雞)、心臟肌肉、數種平滑肌而進行，同時也包括部分非肌肉系統肌球蛋白的研究．在魚類中研究較多的是平滑肌組成的心肌肌球蛋白和橫紋肌組成的肌肉肌球蛋白[4]．肌球蛋白不同類型的重鏈基因全序列克隆測序在多種脊椎動物中已經完成，其中包括大鼠(Rattasnorvergicus)[5]、雞[6]、人[7]以及魚類中的斑馬魚[8]、大頭魚、虹鱒[9]、鯉魚[10]，大黃魚[11]和鱖魚[12]等．因此，對魚類肌球蛋白分子研究已擴展到不同魚類品種肌球蛋白重鏈、輕鏈的基因克隆分析及其表達．Lied和Decken采用生物化學方法分離提取出虹鱒肌球蛋白重鏈，并采用此蛋白作為抗原制備出多克隆抗體，鑒定出其結合蛋白[11]．Crockford等[13]和Goldspink等[14]采用哺乳動物cDNA序列為引物從鯉魚基因文庫中克隆出其肌球蛋白重鏈基因，且證實此類基因表達受環境因子所控制；Kato和Konno測定出鯉魚重鏈氨基末端和羥基末端分子結構和調節區域[15]．有關魚類肌肉特異性基因肌球蛋白輕鏈(myosin light chains，MLC)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chains，MyHC)的cDNA序列分析所獲取的數據，為蛋白質和基因結構進化分析提供基礎．這些克隆和分離的基因已經用于研制核酸雜交探針，來研究肌球蛋白基因家族轉錄產物特異性組織表達、進化，以及染色體定位或突變等．

本研究旨在通過將鱖魚肌球蛋白重鏈基因片段亞克隆到pET-32a質粒，構建出重組表達載體，大量誘導表達此蛋白，制備鱖魚肌球蛋白重鏈多克隆抗體，為日后分析鱖魚肌球蛋白重鏈基因表達對其肉質性狀的影響，進而提高魚類肉質品質提供理論基礎和技術支持．

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑

體重1 kg 左右的鮮活鱖魚購買于長沙水產市場，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80 ℃冰箱保存備用．大腸桿菌菌種BL21(DE3)和DH5α均購于北京天根公司．原核表達載體pET-32a為本實驗室保存．限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ購于TAKARA公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；100 bp Marker、MarkerⅢ、PCR擴增所需的試劑以及一抗Anti-His Antiboby 和二抗羊抗鼠購于北京天根公司；T4DNA連接酶、低相對分子質量標準預染及非預染蛋白質Marker購于Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于Promega公司；His融合蛋白純化預裝柱購于上海悅克生物科技有限公司．羊抗兔辣根過氧化物酶標二抗、DBA顯色試劑盒購于武漢博士德生物公司．其余化學試劑均為國產分析純．

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據作者已克隆得到的鱖魚MyHC全長序列(GenBank：HQ829291)及原核表達載體pET-32a的載體圖譜，利用Primer Premer5.0軟件設計一對引物，其序列分別為：

上游引物P+ 5′CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3′(雙下劃線部分為引入的EcoRⅠ 酶切位點，粗體字為引入的起始密碼子)；

下游引物P-5′GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC3′(雙下劃線部分為引入的HindⅢ 酶切位點，粗體字為引入的終止密碼子)．

1.2.2 目的基因PCR擴增 采用Trizol一步抽提法提取鱖魚肌肉組織的總RNA后根據反轉錄試劑盒(Fermentas)合成第一鏈cDNA，并以其為模板進行PCR擴增．PCR擴增條件為：94 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃反應10 min．PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA膠回收試劑盒進行純化．

1.2.3 原核表達載體構建 pET-32a質粒經EcoRⅠ和HindⅢ 雙酶切處理回收后與同種酶雙酶切后的PCR純化產物在T4DNA連接酶的作用下16 ℃過夜，將目的基因定向連接到pET-32a載體上，再轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，接種于含50 mg/L氨芐青霉素LB固體培養基平板上37 ℃過夜培養，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，提取質粒進行雙酶切鑒定，挑選陽性克隆送上海生工生物有限公司測序．

1.2.4 重組質粒的原核表達及重組蛋白的純化 把構建好的表達載體pET-32a-MyHC轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，取單個菌落接種到LB液體培養基中，37 ℃振蕩過夜，取上述培養物以體積比1∶100比例接種于200 mL LB液體培養基，37 ℃振蕩培養3 h左右，至OD600值達0.5時，取1 mL菌液作為誘導前對照，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol/L的IPTG，37 ℃分別誘導1、2、3、4、5 h，收集菌液進行150 g/L SDS-PAGE電泳，觀察不同IPTG濃度和誘導時間對目的蛋白表達量的影響．

1.2.5 抗血清的制備 用 Ni-NTA 純化表達的鱖魚MyHC融合蛋白，然后將純化的MyHC融合蛋白皮下多點注射新西蘭兔，共免疫3次．注射的抗原均為MyHC蛋白與弗氏完全佐劑按體積比1∶1混合液．首次免疫后，每隔兩周加強免疫一次．末次加強免疫后兩周采集少量血液，ELISA檢測血清抗體效價．之后，頸動脈放血，離心分離血清，即得到鱖魚MyHC蛋白的多克隆抗體，分裝后-80 ℃保存．

1.2.6 Western blot分析抗體特異性 使用哺乳動物細胞蛋白提取試劑盒提取鱖魚肌肉組織總蛋白，-20 ℃保存備用．分別取空白質粒pET-32a細菌裂解液、鱖魚肌肉總蛋白、純化的MyHC蛋白，經100 g/L SDS-PAGE電泳后濕法轉到NC膜上，使用50 g/L脫脂奶粉/TBST 4 ℃封閉過夜．加入一抗(兔抗MyHC血清，濃度比1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育，TBST清洗3次后加入二抗(HRP標記的羊抗兔IgG，濃度比1∶2 000稀釋)，TBST清洗，HRP-DAB顯色，至出現明顯條帶后終止反應．

1.2.7 免疫組化分析抗體的特異性 石蠟切片脫蠟、水化；3%(體積分數)H2O2室溫孵育15 min；蒸餾水沖洗，微波爐內抗原修復15 min；自然冷卻后，蒸餾水沖洗；PBS沖洗3次，每次5 min；50 g/L BSA室溫封閉30 min；傾去封閉液，滴加濃度比1∶2 000稀釋的兔抗MyHC多克隆抗體(一抗)，室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗生物素標記兔IgG(濃度比1∶1 000)，室溫孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；BCIP/NBT顯色；自來水沖洗，核固紅輕度復染，水洗，干燥后水溶性封片劑封片，鏡檢．用PBS代替一抗作為陰性對照．

2 實驗結果

2.1 重組表達載體pET-32a-MyHC的構建

將重組表達質粒pET-32a-MyHC經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定結果如圖1．其中，大于4 500 bp條帶為酶切載體大小，500 bp左右的條帶為目的基因片段大小．同時以單菌落為模板，經菌落PCR鑒定，結果如圖2，可見在500～600 bp間有一條明顯的特異條帶．

M：Marker Ⅲ；1：重組質粒雙酶切 M：100 bp Marker；1：菌落PCR圖1 pET-32a-MyHC酶切鑒定瓊脂糖電泳結果 圖2 目的基因片段菌落PCR鑒定結果

挑選陽性重組克隆菌送至上海英竣生物技術有限公司測序，獲得了一條1 078 bp的基因序列，通過DNAstar軟件分析，該序列37-621位核苷酸序列(包括酶切位點)與預期插入pET-32a載體的肌球蛋白重鏈基因片段一致，該目的基因片段長567 bp．重組表達菌體測序結果與原序列完全一致，且有很好的完整性，說明MyHC目的片段按正確方向插入了pET-32a表達載體中，成功構建了表達載體pET-32a-MyHC．

2.2 鱖魚MyHC原核表達及條件優化

將重組表達載體pET-32a-MyHC(實驗組)和空載體pET-32a(對照組)轉化到宿主菌BL21中，分別利用IPTG誘導，經SDS-PAGE檢測結果如圖3和圖4．其中，對照組顯示一條相對分子質量約為17 000的特異性條帶，即為pET載體的His標簽蛋白；而實驗組在相對分子質量約40 000處出現一條較明亮的條帶，即為His-MyHC融合蛋白．His標簽蛋白的相對分子質量約為17 000，而插入的小清蛋白目的片段預測其蛋白相對分子質量大約為25 000，因此，MyHC融合蛋白的相對分子質量理論上接近40 000，這與SDS-PAGE電泳結果一致，表明重組表達質粒pET-32a-MyHC經IPTG誘導后在大腸桿菌BL21中成功表達出His-MyHC融合蛋白．

M：蛋白Marker ； 1～5：不同IPTG濃度誘導的含pET-32a-MyHC的BL21菌體，其IPTG濃度依次為0，0.2，0.6，0.8，1.2 mmol/L；6：0.8 mmol/L IPTG誘導的含pET-32a的BL21菌體圖3 鱖魚MyHC基因不同IPTG濃度誘導表達結果

M：蛋白Marker ；1，2：0.8 mmol/L IPTG下誘導的含pET-32a的BL21菌體；3-8：誘導0，1，2，3，4，5 h誘導的含pET-32a-MyHC的BL21菌體圖4 鱖魚MyHC基因不同時間誘導表達結果

2.3 MyHC重組融合蛋白表達形式

0.8 mmol/L IPTG，37 ℃誘導培養4 h后，菌體進行超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測，結果顯示上清液中有目的條帶，如圖5，證明MyHC重組蛋白主要以可溶的形式存在．

2.4 Western-blot鑒定重組融合蛋白

重組蛋白pET-32a-MyHC在SDS-PAGE電泳后，通過電轉移將表達產物轉移到硝酸纖維素膜上，利用抗His為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG-HRP為二抗，在HRP-DAB底色顯色反應下，對pET-32a-MyHC轉化到BL21菌中并表達的重組融合蛋白進行Western檢測分析(圖6右)，結果表明，經IPTG誘導后的目的蛋白pET-32a-MHC可以和抗體發生強烈的免疫反應．因此可以確定重組載體成功表達了重組融合蛋白(相對分子質量約40 000的蛋白為目的蛋白)．

M：蛋白Marker;1：未誘導的重組質粒；2：含重組質粒菌體誘導后破碎沉淀；3：含重組質粒菌體誘導后破碎上清液圖5 MyHC融合蛋白表達的SDS-PAGE分析

2.5 間接ELISA對抗體效價的測定

以純化后的表達產物融合蛋白MyHC作為抗原，100 μg /孔包被，以HRP標記的羊抗兔IgG抗體作為二抗，用免疫后的兔血清抗體做梯度稀釋，以免疫前兔血清為陰性對照，ELISA間接法測抗體，結果顯示陰性對照一直無明顯的變化，而當多克隆抗體稀釋倍數為4.0×106時，純化好的融合蛋白與陰性對照OD值比仍大于2倍．因此，融合蛋白MyHC對兔抗多克隆抗體具有良好的免疫原性，抗體滴度為1∶(4×106)(圖7)．

2.6 鱖魚MyHC蛋白免疫印跡

分別取空白質粒pET-32a細菌裂解液，抽提鱖魚肌肉總蛋白(蛋白提取液：1%的NP-40(體積分數，下同)；1 g/L SDS；9.1 mmol/L Na2HPO4；2.94 mmol/L NaH2PO4；0.15 mol/L NaCl；10% PMSF；5 g/L Leupeptin；5 g/L NaDeoxgcholate)，經SDS-PAGE電泳后轉印至NC膜上，50 g/L脫脂牛奶4 ℃封閉過夜．加入一抗(兔抗MYH血清，1∶5 000稀釋)，TBST(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，體積分數為0.05% Tween 20)清洗3次，每次5 min；然后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min；最后加入DAB顯色，待出現明顯條帶后用水沖洗終止反應．

預測鱖魚肌球蛋白重鏈蛋白相對分子質量約為 240 000[16]．用自制的MYH抗兔血清對鱖魚總蛋白的western blotting 結果(圖8)顯示，在相對分子質量為240 000左右出現清晰的條帶，見圖中第3泳道；而陰性對照空白pET-32a見圖中第4泳道，在相應位置未識別出該蛋白條帶．Western免疫印跡實驗表明，MyHC抗血清可以與肌細胞中相對分子質量為240 000左右的蛋白質發生特異性交叉反應，與文獻報道的MyHC的相對分子質量一致，顯示MyHC多克隆抗體具有高的特異性．

圖7 間接ELISA測抗血清效價

M1：非預染蛋白Marker；1：陰性對照(pET-32a質粒細菌裂解液)；2：鱖魚肌肉總蛋白.M2：預染蛋白Marker ；3：鱖魚肌肉總蛋白；4：陰性對照(pET-32a質粒細菌裂解液)圖8 (A)鱖魚肌肉總蛋白SDS-PAGE檢測結果 (B)鱖魚MyHC蛋白免疫印跡結果

2.7 免疫組化結果

由圖9(放大倍數200×)可以看出，兔抗MyHC多克隆抗體免疫鱖魚肌肉，在背部的肌肉細胞產生陽性細胞(圖9B)，呈黃棕色(灰度處理后為深灰色)，而在陰性對照組中未出現該陽性信號(圖9A)，與預想結果一致，說明該抗體是特異性的．

A 陰性對照 B 陽性圖9 鱖肌肉MyHC免疫組化結果

3 討論

為了獲得穩定的目的基因片段和可溶狀態的重組蛋白，克隆片段起始位置應位于保守性較高且親水性高的區域．作者在設計引物前利用DNAstar軟件對鱖魚肌球蛋白重鏈基因進行親/疏水性預測[16]，結果顯示鱖魚肌球蛋白重鏈基因親水性氨基酸多集中于850～1 983位．分析鱖魚MyHC的保守結構[17]，作者選擇在Myosin_tail_1親水性氨基酸集中的區域(1 404～1 592位氨基酸)對應的核苷酸序列進行克隆和表達．基因的高效表達是在載體、基因和受體細胞的協同作用下完成的，主要受啟動子、SD序列、轉錄終止序列、載體系統等因素的影響[18-21]．宿主的選擇及培養條件的控制等因素對外源基因在原核細胞中的表達效率也有很大影響．本實驗所選用的表達載體大腸桿菌BL21具有T7啟動子，可通過化學誘導高效地表達外源蛋白，目的蛋白前端的促溶蛋白(相對分子質量約為17 000)可以增加蛋白的表達及可溶性．同時，BL21含有6個組氨酸標簽，可以提高外源表達蛋白的表達效率而不影響目的蛋白的高級結構，從免疫組化和免疫印跡結果來看, 作者表達出的帶有His標簽的蛋白也沒有影響到抗原抗體特異結合的性質[22]．同時多聚組氨酸標簽對外源重組蛋白的純化也具有一定的作用．

進行融合蛋白誘導時， 蛋白極易以包涵體的形式表達， 而包涵體形成后的缺點是需變性、 復性等復雜處理過程后才能得到可溶性融合蛋白質．為了避免變性復性等復雜過程，通過改變誘導的時間和 IPTG的濃度，摸索到最適宜的條件為0.8 mmol/L IPTG誘導3 h．

肌球蛋白重鏈( MyHC)具有ATPase活性、肌動蛋白結合位點以及a螺旋卷曲螺旋尾部等重要特性，是決定肌纖維收縮性質的主要分子之一．本研究以前期研究中已經克隆的鱖魚MyHC序列[23-24]為目的基因，利用大腸桿菌BL21作為表達載體，對目的基因進行原核表達載體的構建和多克隆抗體的制備．研究成果為進一步研究肌球蛋白重鏈對肉質的影響，提高優良肉質性狀提供理論支持．

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